• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    草魚鈣網(wǎng)蛋白的克隆與組織表達(dá)

    2012-09-25 01:46:18李旭威王海英吳銳全謝駿郁二蒙吳垠余德光王廣軍龔?fù)麑?/span>
    關(guān)鍵詞:虹鱒胰臟草魚

    李旭威,王海英,吳銳全,謝駿,郁二蒙,吳垠,余德光,王廣軍,龔?fù)麑?/p>

    (1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510380;2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧 大連116023)

    鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)是一種高度保守的分子伴侶蛋白,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中主要的鈣結(jié)合蛋白之一。Ostwald等[1]于1974年首次從骨骼肌肌漿網(wǎng)中提純得到鈣網(wǎng)蛋白,之后Fliegel等[2]和Smith等[3]同時(shí)獲得編碼這種蛋白的cDNA,并將此蛋白命名為高親和力Ca2+結(jié)合蛋白 (high affinity calcium binding protein,HACBP)。直到1991年,Opas等[4]發(fā)現(xiàn) HACBP是一種存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白,并將其重新命名為鈣網(wǎng)蛋白。

    鈣網(wǎng)蛋白在細(xì)胞受到應(yīng)激如炎癥、熱休克、病毒感染時(shí)分泌到細(xì)胞外[5],從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。Asgari等[6]研究發(fā)現(xiàn),菜粉蝶Pierisrapae血細(xì)胞表面的鈣網(wǎng)蛋白具有吞噬作用;在中國(guó)明對(duì)蝦Fenneropenaeuschinensis體內(nèi)注射白斑綜合征病毒(WSSV)6 h后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)量顯著增加,結(jié)果證實(shí)了鈣網(wǎng)蛋白參與病毒侵襲后的免疫過程[7]。

    鈣網(wǎng)蛋白位于大多數(shù)有核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,本身具有凝集素樣功能[8-9],在結(jié)構(gòu)上亦與補(bǔ)體C1q受體類似,補(bǔ)體C1q能與鈣網(wǎng)蛋白結(jié)合,啟動(dòng)補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑。同時(shí),吞噬細(xì)胞膜上的LDL受體相關(guān)蛋白(LDL—receptor related protein,LRP)可識(shí)別凋亡細(xì)胞上鈣網(wǎng)蛋白的功能受體。鈣網(wǎng)蛋白與LRP相互作用可活化吞噬細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號(hào)傳遞系統(tǒng),啟動(dòng)細(xì)胞的內(nèi)吞過程[10]。

    鈣網(wǎng)蛋白基因目前已在斑馬魚Daniorerio、虹鱒Oncorhynchusmykiss[11]、牙鲆Paralichthysolivaceus、中國(guó)明對(duì)蝦Fenneropenaeuschinensis[12]、斑節(jié)對(duì)蝦Penaeusmonodon[13]、斑點(diǎn)叉尾鮰Ictaluruspunctatus[14]中克隆獲得了鈣網(wǎng)蛋白基因序列,在虹鱒、斑點(diǎn)叉尾鮰的鈣網(wǎng)蛋白的研究中也初步了解了魚類鈣網(wǎng)蛋白的特性及其作用。Visudtiphole等[13]的研究表明,鈣網(wǎng)蛋白可作為斑節(jié)對(duì)蝦熱應(yīng)激的生物標(biāo)記物。

    作為中國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一的草魚Ctenopharyngodonidellus,在養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā),由此造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[15-16]。本試驗(yàn)中,作者通過克隆和RACE技術(shù)獲得草魚鈣網(wǎng)蛋白基因全長(zhǎng),并研究了鈣網(wǎng)蛋白在草魚不同組織中的表達(dá)規(guī)律,以期為進(jìn)一步深入研究鈣網(wǎng)蛋白的功能以及在魚類免疫中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)草魚為3尾,購(gòu)自黃沙水產(chǎn)品市場(chǎng),體質(zhì)量為(1.451±0.352)kg。解剖后取肌肉、腸道、肝胰臟、鰓、皮膚、鰭條、腎臟和脾臟,立即放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

    Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自Nitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD-19T載體、DL2000 DNA和Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連TaKaRa公司;SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit和Advantage-2 PCR Kit均購(gòu)自Clontech生物工程公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和DH5α購(gòu)自Tiangen公司。

    1.2 方法

    1.2.1 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 RNA的提取參照Trizol說明書進(jìn)行,利用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度和質(zhì)量。按照TaKaRa RNA PCR Kit試劑盒推薦的方法,以O(shè)ligo(dT)為引物合成cDNA第一鏈。具體步驟如下:取Oligo dT-接頭引物 1 μL、dNTP mixture 1 μL、總RNA 4 μL,加ddH2O至10 μL,于65 ℃下水浴5 min,然后在冰上急速冷卻;取該反應(yīng)液10 μL、5×PrimeScript II Buffer 4 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、PrimeScript I RTase 1 μL,用RNase Free ddH2O加至20 μL。在PCR儀中進(jìn)行如下反應(yīng):42 ℃下變性30 min,99 ℃下退火5 min,5 ℃下延伸 5 min。

    1.2.2 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因cDNA核心序列克隆 根據(jù)GenBank中斑馬魚、虹鱒、小家鼠、人的鈣網(wǎng)蛋白基因mRNA序列設(shè)計(jì)并合成1對(duì)簡(jiǎn)并引物——P1和P2(表1),產(chǎn)物預(yù)計(jì)長(zhǎng)度為495 bp。以草魚肌肉的cDNA為模板, 采用PCR擴(kuò)增目的基因片段。PCR反應(yīng)體系為25 μL,包括ddH2O 19.8 μL、Buffer(含MgCl2) 2.5 μL、dNTP Mix 1 μL、cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃下預(yù)變性3 min;94 ℃下變性1 min,49 ℃ 下退火30 s,72 ℃下延伸 1 min,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收后,與pMD19-T載體連接,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑選陽(yáng)性克隆,最后通過PCR反應(yīng)檢測(cè)得到陽(yáng)性克隆,陽(yáng)性克隆由上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,所得cDNA片段與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行Blast同源性分析。

    表1 試驗(yàn)用引物序列

    1.2.3 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因cDNA 3′RACE的克隆 3′RACE的操作按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0試劑盒方法進(jìn)行。首先以試劑盒提供的Oligo dT-Adaptor primer為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),用上述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、5×PCR Buffer 10 μL、ddH2O 28.75 μL、TaKaRa Ex Taq?HS 0.25 μL、上游特異性引物P3(表1)0.5 μL和M13 Primer M4 0.5 μL進(jìn)行首次PCR反應(yīng)。具體反應(yīng)條件為:94 ℃下預(yù)變性3 min;94 ℃下變性30 s,55 ℃下退火30 s,72 ℃下延伸1 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。巢式PCR所用引物為M13 Primer M4和P4(表1)。PCR產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè),并回收、克隆后測(cè)序。

    1.2.4 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因cDNA 5′RACE的克隆 根據(jù)克隆得到的草魚鈣網(wǎng)蛋白基因的cDNA核心片段,以SMARTTMRACE cDNA Amp lification Kit (Clotech)引物設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)2個(gè)下游引物P5與P6(表1),上游引物由試劑盒提供。5′RACE cDNA合成用試劑盒提供的5′-CDS Primer A與SMART II A Oligo引物。取總RNA 2 μL,合成5′RACE cDNA方法按照試劑盒說明進(jìn)行。得到5′RACE cDNA后進(jìn)行首次PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94 ℃下變性30 s,65 ℃下退火30 s,72 ℃下延伸 3 min,共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。取首次擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL,加入245 μL的Tricine-EDTA buffer,然后取5 μL作為巢式PCR的cDNA。擴(kuò)增條件為:94 ℃下預(yù)變性30 s,65 ℃下退火30 s,72 ℃下延伸3 min,共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。RACE產(chǎn)物純化、克隆和測(cè)序方法同上。

    1.3 鈣網(wǎng)蛋白基因的氨基酸序列相似性分析

    用NCBI中Blast軟件將獲得的cDNA序列進(jìn)行拼接,得到鈣網(wǎng)蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA序列。用Vector 8.0程序搜索開放閱讀框并預(yù)測(cè)氨基酸序列,采用ClustalX 1.83 對(duì)不同物種的鈣網(wǎng)蛋白基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),然后用Mega 3.1軟件構(gòu)建NJ進(jìn)化樹。

    1.4 不同組織中Ci-CRT的表達(dá)

    用“1.2”中的方法得到不同組織的cDNA模板,根據(jù)目的基因的全長(zhǎng)cDNA序列,設(shè)計(jì)1對(duì)RT-PCR特異引物P7與P8(表1),以草魚的β-actin基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)參引物P9與P10(表1)。PCR反應(yīng)體系同上。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃下預(yù)變性3 min;94 ℃下變性30 s,49 ℃下退火30 s,72 ℃下延伸1 min,共進(jìn)行32個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min。試驗(yàn)重復(fù)3次。

    2 結(jié)果

    2.1 鈣網(wǎng)蛋白基因全長(zhǎng)cDNA序列的特征分析

    草魚鈣網(wǎng)蛋白擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Vector NTI Suite 8.0軟件包中的Contig Express程序進(jìn)行重復(fù)序列的識(shí)別和拼接,得到鈣網(wǎng)蛋白全長(zhǎng)cDNA為1 389 bp,包含1 263 bp的開放閱讀框,編碼為421個(gè)氨基酸,長(zhǎng)度為69 bp的5′UTR和長(zhǎng)度為57 bp的3′UTR。利用ProtParam程序(http://www.expasy. org/)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行基本的物理化學(xué)性質(zhì)分析,預(yù)測(cè)該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為48 700,理論等電點(diǎn)為4.33。經(jīng)SignalP軟件預(yù)測(cè),氨基酸N-端是由21個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的疏水信號(hào)肽( MQIITLFPFVSAALLALAANA ),且發(fā)現(xiàn)兩個(gè)保守的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽(KHEQKIDCGGGYVKVF與IMFGPDICG),以及另外兩個(gè)鈣網(wǎng)蛋白家族保守重復(fù)序列A和B(PXXIXDPDAXKPEDWDE與GXWXPPXIXNPXYX)(圖1)。

    2.2 序列比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化分析

    選擇哺乳類、魚類、蝦蟹類、昆蟲等物種的鈣網(wǎng)蛋白的氨基酸序列(圖2)進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),草魚鈣網(wǎng)蛋白基因功能域具有較高的保守性,在C-端都有保守K/HDEL標(biāo)簽,且氨基酸序列與斑馬魚(NM_131047.1)、虹鱒(NM_001124478.1)的相似性分別為86.26%、76.78%,與中國(guó)明對(duì)蝦(DQ323054.1)的相似性為63.83%,與人(BT007448.1)、牛(BC140582.1)、果蠅(NP_524293)和小家鼠(NM_007591.3)的相似性分別為69.67%、70.38%、62.17%和69.19%。

    對(duì)鈣網(wǎng)蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,構(gòu)建的進(jìn)化樹與傳統(tǒng)的生物界的劃分比較一致。構(gòu)建的分子進(jìn)化樹可以簡(jiǎn)單的將基因聚類為植物、脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物。已獲得的草魚鈣網(wǎng)蛋白核苷酸序列與小家鼠、人、牛、非洲爪蟾、其它的魚類聚為一類;家蠶、果蠅與中國(guó)明對(duì)蝦、太平洋牡蠣等無脊椎動(dòng)物聚為一類;而小麥等植物位于進(jìn)化樹的最下方(圖3)。

    2.3 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因的組織表達(dá)

    通過半定量RT-PCR分析顯示,鈣網(wǎng)蛋白基因在草魚的肌肉、腸道、肝胰臟、鰓、皮膚、鰭條、腎臟和脾臟中均有表達(dá)(圖4)。以鈣網(wǎng)蛋白基因與β-actin電泳帶吸光度的比值繪制了鈣網(wǎng)蛋白在草魚各組織的表達(dá)相對(duì)豐度(圖5)。從圖5可見:鈣網(wǎng)蛋白基因在肝胰臟、鰭條的表達(dá)量均較高,顯著高于肌肉、腸道、鰓、腎臟、脾臟(P<0.05),但與皮膚無顯著差異(P>0.05);鈣網(wǎng)蛋白基因在皮膚中的表達(dá)量次之。

    3 討論

    鈣網(wǎng)蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上主要的Ca2+結(jié)合蛋白,具有調(diào)控細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存功能的作用,并且參與細(xì)胞黏附、傷口愈合、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與病理變化等過程[17-18]。隨著對(duì)鈣網(wǎng)蛋白的深入研究,發(fā)現(xiàn)人類和小家鼠還具有不同基因型(2型鈣網(wǎng)蛋白基因,calreticulin-2),在大鼠、牛中也相繼發(fā)現(xiàn)2型鈣網(wǎng)蛋白基因[19]。本研究中的草魚鈣網(wǎng)蛋白基因是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中虹鱒、牙鲆、斑馬魚等的鈣網(wǎng)蛋白序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物克隆獲得的,基因全長(zhǎng)為1 389 bp,由基因推導(dǎo)的氨基酸序列在結(jié)構(gòu)上與哺乳類的鈣網(wǎng)蛋白一樣,分為N-、P-和C- 3個(gè)功能域。經(jīng)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),其與斑馬魚、虹鱒具有較高的同源性,序列含有兩個(gè)高度保守的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽(KHEQKIDCGGGYVKVF 100~116和IMFGPDICG 132~140)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收信號(hào)四肽(H/KDEL)區(qū)域[20]。而所知的人類和小家鼠的calreticulin-2與calreticulin相比,其在C末端只具有-EL區(qū)域,而不具有鈣網(wǎng)蛋白的回收信號(hào)四肽序列[19]。由此推知,本試驗(yàn)中從肝胰臟克隆的基因應(yīng)為草魚calreticulin。Liu等[14]發(fā)現(xiàn),斑點(diǎn)叉尾鮰鈣網(wǎng)蛋白具有calreticulin和calreticulin-like 2。草魚鈣網(wǎng)蛋白是否存在不同的基因型還有待進(jìn)一步研究。

    注:雙下劃線表示信號(hào)肽,方框表示兩個(gè)保守的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽,粗體下劃線表示重復(fù)序列,星號(hào)表示終止密碼子。Note:The predicted signal peptide is indicated with double underlined,CRT family signature motifs are boxed, repeat sequences are indicated with underlined bold text, and stop codon is indicated by asterisk.圖1 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因cDNA全長(zhǎng)序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of full-length Calreticulin(CRT) cDNA in grass carp

    本試驗(yàn)中,利用RT-PCR方法檢測(cè)鈣網(wǎng)蛋白在草魚肝胰臟、脾、腸道、鰓、肌肉、鰭條、皮膚、腎臟中的表達(dá)分布情況,結(jié)果表明,在草魚的8個(gè)組織器官中均可檢測(cè)到鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá),其中在肝肝胰臟和鰭條中的表達(dá)量較高,且兩者表達(dá)量都高于其它6個(gè)組織。Kales等[11]研究了虹鱒的鈣網(wǎng)蛋白,在虹鱒的肌肉、頭腎、肝胰臟、中腎、鰓、脾臟、心臟、腦和腸道中均檢測(cè)到其表達(dá),其中在肝胰臟中的表達(dá)量高于其它組織,這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。在Liu等[14]的研究中,選取斑點(diǎn)叉尾鮰的脾臟、肌肉、中腎、頭腎、腦、心臟、鰓、胃、腸道和皮膚10個(gè)組織器官進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明,鈣網(wǎng)蛋白在各組織中均能表達(dá),亦發(fā)現(xiàn)其在肝胰臟中的表達(dá)量較高。肝胰臟作為免疫系統(tǒng)中的重要器官,由于其中存在大量的巨噬細(xì)胞等先天性免疫組分,在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、修復(fù)損傷中發(fā)揮重要作用,許多抗病毒相關(guān)基因在肝胰臟中的表達(dá)量都較高[21]。

    在體外試驗(yàn)中,鈣網(wǎng)蛋白與HSP70、HSP90、gb96一樣能夠直接激活免疫細(xì)胞[22]。鈣網(wǎng)蛋白在應(yīng)激狀態(tài)下也會(huì)發(fā)生變化,如鈣網(wǎng)蛋白在熱應(yīng)激情況下,為了維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),其表達(dá)呈上調(diào)的趨勢(shì),而在低氧、缺氧的情況下,鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)也都呈上調(diào)趨勢(shì)[23-24]。草魚是中國(guó)淡水池塘養(yǎng)殖的主要種類之一,在養(yǎng)殖過程中,草魚的發(fā)病率高且難治愈。鑒于鈣網(wǎng)蛋白在免疫和應(yīng)激方面存在的潛在作用,加強(qiáng)對(duì)草魚鈣網(wǎng)蛋白功能的進(jìn)一步研究是十分必要的。

    注:人Homo sapiens(BT007448.1),小家鼠Mus musculus(NM_007591.3),牛Bos taurus(BC140582.1),果蠅Drosophila melano gaster(NM_079569.4),中國(guó)明對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis(DQ323054.1),草魚Ctenopharyngodon idellus, 斑馬魚Danio rerio(NM_131047.1),虹鱒Oncorhynchus mykiss(NM_001124478.1)。圖2 草魚鈣網(wǎng)蛋白基因氨基酸序列的比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence alignment of Calreticulin (CRT) in grass carp

    圖3 鈣網(wǎng)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Calreticulin (CRT)

    注:M為DL 2000 marker;1~8、9~16、17~24為3組重復(fù),依次對(duì)應(yīng)肌肉、腸道、肝胰臟、鰓、皮膚、鰭條、腎臟、脾臟。Note:M,DL 2000 marker;1-8,9-16,17-24 triplication;1,muscle;2,intestine; 3,hepatopancreas; 4,gill; 5,skin; 6,ray; 7,kidney; 8, spleen.圖4 Calreticulin mRNA 在草魚不同組織中的表達(dá)電泳圖譜Fig.4 Expression of Calreticulin mRNA in different tissues of grass carp by RT-PCR

    圖5 Calreticulin mRNA在草魚不同組織中表達(dá)量的分析Fig.5 The significance tests of Calreticulin mRNA expression in different tissues of grass carp

    參考文獻(xiàn):

    [1] Ostwald T J,Maclennan D H.Isolation of a high affinity calcium-binding protein from sarcoplasmic reticulum[J].The Journal of Biologlcal Chemist,1974,249:974-979.

    [2] Fliegel L,Burns K,MacLennan D H,et al.Molecular cloning of the high affinity calcium-binding protein (calreticulin) of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum[J].The Journal of Biologlcal Chemist,1989,264:21522-21528.

    [3] Smith G L,Koch E.Multiple zones in the sequence of calreticulin (CRP55,calregulin,HACBP),a major calcium-binding ER/SR protein[J].EMBO Journal,1989,8(12):3581- 3586.

    [4] Opas M,Dziak E,Fliegel L,et al.Regulation of expression and intracellular distribution of calretieulin,a major calcium binding protein of nonmusele cells[J].Journal of Cellular Physiology,1991,149 (1):160-171.

    [5] Park B J,Lee D J,Yu J R,et al.Calreticulin,a calcium-binding molecular chaperone,is required for stress response and fertility inCaenorhabditiselegans[J].Molecular Biology of the Cell,2001(9):2835-2845.

    [6] Asgari S,Schmidt O.Is cell surface calreticulin involved in phagocytosis by insect hemocytes?[J].Journal of Insect Physiology,2003,49(6):545-550.

    [7] Wang B,Li F H,Dong B,et al.Discovery of the genes in response to white spot syndrome virus (WSSV) infection inFenneropenaeuschinensisthrough cDNA microarray[J].Marine Biotechnology,2006,8(5):491-500.

    [8] Kasper G,Brown A,Eberl M,et al.A calreticulin-like molecule from the human hookwormNecatoramericanusinteracts with Clq and the cytoplasmic signaling domains of some integrins[J].Parasite Immunology,2001,23(3):141-152.

    [9] Michalak M,Corbett E F,Mesaeli N,et al.Calreticulin:one protein,one gene,many functions[J].Biochem J,1999,344(2):281-292.

    [10] Gardai S J,McPhillips K A,Frasch S C,et al.Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte[J].Cell,2005,123(2):321-334.

    [11] Kales S,Fujiki K,Dixon B.Molecular cloning and characterization of calreticulin from rainbow trout(Oncorhynchusmykiss)[J].Immunogenetics,2004,55 (10) :717-723.

    [12] Wei L N,Li F H,Xiang J H,et al.Molecular characteristics and expression analysis of calreticulin in Chinese shrimpFenneropenaeuschinensis[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,2007,147(3): 482-491.

    [13] Visudtiphole V,Watthanasurorot A,Klinbunga S,et al.Molecular characterization of Calreticulin:A biomarker for temperature stress responses of the giant tiger shrimpPenaeusmonodon[J].Aquaculture,2010,308(1):100-108.

    [14] Liu H,Peatman E,Wang W Q,et al.Molecular responses of calreticulin genes to iron overload and bacterial challenge in channel catfish (Ictaluruspunctatus)[J].Developmental and Comparative Immunology,2011,35(3):267-272.

    [15] 張春雨.池塘草魚病害的發(fā)生與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008,22:240-242.

    [16] 王方華,李安興.草魚病毒性出血病研究進(jìn)展[J].南方水產(chǎn),2006,2(3):66-71.

    [17] Kwon M S,Park C S,Choi K,et al.Calreticulin couples calcium release and calcium influx in integrin-mediated calcium signaling[J].Molecular Biology of the Cell, 2000,11:1433-1443.

    [18] Johnson S,Michalak M,Opas M,et al.The in and outs of calreticulin:from the ER lumen to the extracellular space[J].Trends Cell Biol,2001,11 (3):122-129.

    [19] Persson S,Rosenquist M,Sommarin M.Identification of a novel calreticulin isoform (Crt2) in human and mouse[J].Gene,2002,297(1-2):151-158.

    [20] Michalak M,Parker J M R,Opas M.Ca2+signaling and calcium binding chaperones of the endoplasmic reticulum[J].Cell Calcium,2002,32(5-6):269-278.

    [21] Pigeon C,Ilyin G,Courselaud B,et al.A new mouse liver-specific gene,encoding a protein homologous to human antimicrobial peptide hepcidin,is over expressed during iron over load[J].Biol Chem,2001,276(11):7811-7819.

    [22] Hong Ch,Qiu X, Li Y, et al.Functional analysis of recombinant calreticulin fragment 39-272:implications for immunobiological activities of calreticulin in health and disease[J].The Journal of Immunology, 2010,185(8):4561-4569.

    [23] Nguyen T Q,Capra J D,Sontheimer R D. Calreticulin is transcriptionally upregulated by heat shock,calcium and heavy metals[J].Molecular Immunology,1996,33(4-5):379-386.

    [24] Kawabe S,Yokoyama Y.Molecular cloning of calnexin and calreticulin in the Pacific oysterCrassostreagigasand its expression in response to air exposure[J].Marine Genomics,2010,3(1) 19-27.

    猜你喜歡
    虹鱒胰臟草魚
    見證!草魚、加州鱸再度崛起
    見證!草魚再次崛起
    虹鱒人工繁育研究綜述
    動(dòng)漫show 《我想吃掉你的胰臟》 活下去的方式有很多種,有一種叫愛
    屋檐下的小草魚
    外源性γ—氨基丁酸對(duì)內(nèi)在膽堿能神經(jīng)興奮引發(fā)的胰臟外分泌的影響
    海水工廠化養(yǎng)殖虹鱒營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析與評(píng)價(jià)
    飼料鉛脅迫對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)性能及肝胰臟抗氧化能力的影響
    廣東飼料(2016年2期)2016-12-01 03:43:06
    草魚“四大病”癥狀及防治方法(上)
    虹鱒魚的故事
    欧美一区二区国产精品久久精品| 内地一区二区视频在线| 欧美激情在线99| 少妇丰满av| 日韩一区二区视频免费看| 99热6这里只有精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 色5月婷婷丁香| 欧美丝袜亚洲另类 | 日韩精品有码人妻一区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲中文日韩欧美视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 男女那种视频在线观看| 春色校园在线视频观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美人与善性xxx| 久久久久性生活片| 亚洲熟妇熟女久久| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲精品在线观看二区| 可以在线观看毛片的网站| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产老妇女一区| 久久久久精品国产欧美久久久| 成年人黄色毛片网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美成人a在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 麻豆成人av在线观看| 国产成人影院久久av| 99热只有精品国产| 无遮挡黄片免费观看| 看黄色毛片网站| 在线看三级毛片| 日韩av在线大香蕉| 高清日韩中文字幕在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 精品久久久噜噜| 亚洲欧美激情综合另类| 九色成人免费人妻av| 精品人妻1区二区| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品一区www在线观看 | 日日干狠狠操夜夜爽| 99久久中文字幕三级久久日本| 又紧又爽又黄一区二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品永久免费网站| av在线亚洲专区| 午夜日韩欧美国产| 国产av一区在线观看免费| 午夜福利视频1000在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 99国产极品粉嫩在线观看| 波野结衣二区三区在线| 99热精品在线国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 直男gayav资源| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美zozozo另类| 少妇的逼好多水| 国产精品一及| 午夜影院日韩av| 大型黄色视频在线免费观看| 成年女人看的毛片在线观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲美女视频黄频| 美女免费视频网站| 国产高清不卡午夜福利| 久久久精品大字幕| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 99九九线精品视频在线观看视频| av国产免费在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 超碰av人人做人人爽久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品久久久久久久电影| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 99精品在免费线老司机午夜| 高清在线国产一区| 老司机午夜福利在线观看视频| 超碰av人人做人人爽久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品午夜福利在线看| 国产精品亚洲一级av第二区| 成人国产综合亚洲| 中国美白少妇内射xxxbb| 看免费成人av毛片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 少妇的逼好多水| 日本欧美国产在线视频| 精品人妻熟女av久视频| 精品人妻熟女av久视频| 国产高清视频在线观看网站| 日韩一本色道免费dvd| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 黄色欧美视频在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 91精品国产九色| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜福利成人在线免费观看| 一级av片app| 亚洲最大成人手机在线| 一夜夜www| 欧美日韩乱码在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 99热只有精品国产| 色哟哟·www| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 成人国产一区最新在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美日韩乱码在线| 69av精品久久久久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美性感艳星| 亚洲精品粉嫩美女一区| 无遮挡黄片免费观看| 国产探花极品一区二区| 赤兔流量卡办理| 可以在线观看毛片的网站| 看片在线看免费视频| 联通29元200g的流量卡| 免费一级毛片在线播放高清视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 18禁在线播放成人免费| 麻豆国产97在线/欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 乱人视频在线观看| 69人妻影院| 变态另类丝袜制服| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 午夜福利高清视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 一区二区三区激情视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 少妇熟女aⅴ在线视频| 男女那种视频在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 级片在线观看| av黄色大香蕉| 国产精品电影一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 成年女人毛片免费观看观看9| 九九热线精品视视频播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 在线天堂最新版资源| 两个人的视频大全免费| 日本黄大片高清| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲在线观看片| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 日本熟妇午夜| 亚洲最大成人中文| 99热这里只有精品一区| 成人亚洲精品av一区二区| av黄色大香蕉| 国产成人一区二区在线| 免费看光身美女| av在线蜜桃| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲精品一区av在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 欧美区成人在线视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本黄色视频三级网站网址| 免费av毛片视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美日本视频| 午夜福利18| 婷婷色综合大香蕉| 一区福利在线观看| 久久久午夜欧美精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久久精品大字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品伦人一区二区| 可以在线观看的亚洲视频| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 在线播放无遮挡| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 一a级毛片在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 变态另类丝袜制服| 久久午夜福利片| 精品午夜福利视频在线观看一区| 天堂网av新在线| 黄色一级大片看看| 日本与韩国留学比较| 少妇丰满av| АⅤ资源中文在线天堂| 一个人观看的视频www高清免费观看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 搡女人真爽免费视频火全软件 | 直男gayav资源| 婷婷丁香在线五月| 亚洲国产色片| 久久午夜福利片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 色哟哟·www| 国模一区二区三区四区视频| 国产美女午夜福利| 干丝袜人妻中文字幕| 免费在线观看日本一区| 国产老妇女一区| 我的老师免费观看完整版| 在线观看av片永久免费下载| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产成人av教育| 一级av片app| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国内精品久久久久精免费| 国产午夜精品论理片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 成年版毛片免费区| 国产乱人视频| av在线观看视频网站免费| 国产三级在线视频| 黄片wwwwww| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品一及| 午夜福利欧美成人| 国产私拍福利视频在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 国产真实乱freesex| 熟女人妻精品中文字幕| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲精品456在线播放app | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 久久精品91蜜桃| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久久久伊人网av| 国产高清视频在线观看网站| 香蕉av资源在线| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美成人一区二区免费高清观看| 两个人视频免费观看高清| 最近最新免费中文字幕在线| 乱系列少妇在线播放| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 性色avwww在线观看| 亚洲性久久影院| 天堂√8在线中文| 在现免费观看毛片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| a级毛片免费高清观看在线播放| 性色avwww在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 日韩中字成人| 嫩草影院精品99| or卡值多少钱| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 91久久精品国产一区二区三区| 91久久精品国产一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜日韩欧美国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲自拍偷在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 天天一区二区日本电影三级| 成人国产一区最新在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 不卡一级毛片| 波多野结衣高清无吗| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 色吧在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产真实乱freesex| 色综合婷婷激情| 深夜a级毛片| 亚洲无线在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 一本久久中文字幕| 国产视频内射| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产成人一区二区在线| 麻豆成人av在线观看| 1000部很黄的大片| 97碰自拍视频| 国产一区二区三区av在线 | 99久久精品国产国产毛片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人无遮挡网站| 欧美丝袜亚洲另类 | 五月伊人婷婷丁香| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美黑人巨大hd| 99热这里只有精品一区| 国产精品不卡视频一区二区| 一个人看的www免费观看视频| 日本黄大片高清| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美zozozo另类| 国产在视频线在精品| 国产精品久久久久久久电影| 久久精品国产清高在天天线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久九九热精品免费| xxxwww97欧美| 免费观看精品视频网站| 亚洲,欧美,日韩| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 一级a爱片免费观看的视频| 精品久久久久久久久av| 久久久久九九精品影院| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 天堂动漫精品| 一区二区三区四区激情视频 | 91在线观看av| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 亚洲真实伦在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜精品久久久久久毛片777| 日韩国内少妇激情av| 色哟哟·www| 国产精品永久免费网站| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产主播在线观看一区二区| 天美传媒精品一区二区| 国产亚洲精品久久久com| 免费在线观看成人毛片| 久久久精品大字幕| 国产毛片a区久久久久| 日韩精品有码人妻一区| 十八禁网站免费在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 日本一二三区视频观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 色综合婷婷激情| 久久精品91蜜桃| 在线观看av片永久免费下载| 无遮挡黄片免费观看| 我要看日韩黄色一级片| 一本一本综合久久| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产高清有码在线观看视频| 最后的刺客免费高清国语| 欧美中文日本在线观看视频| 国产探花极品一区二区| 午夜福利在线在线| 国产一区二区在线av高清观看| 一进一出抽搐动态| 91在线观看av| 日韩国内少妇激情av| 国产一区二区三区视频了| www.色视频.com| 最后的刺客免费高清国语| 日韩欧美国产在线观看| 午夜福利在线在线| 观看美女的网站| 亚洲人成网站在线播| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲av一区综合| 欧美另类亚洲清纯唯美| 全区人妻精品视频| 国产精品av视频在线免费观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 最近最新中文字幕大全电影3| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩中字成人| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜爱爱视频在线播放| 日本熟妇午夜| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲精品色激情综合| 在现免费观看毛片| 少妇的逼水好多| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品人妻久久久影院| 能在线免费观看的黄片| 免费观看精品视频网站| 国产精品一区二区性色av| 久久久久久伊人网av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 国产黄片美女视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| av在线天堂中文字幕| 亚洲avbb在线观看| 我的老师免费观看完整版| 嫩草影院新地址| 色av中文字幕| 亚洲专区国产一区二区| 国产不卡一卡二| 麻豆成人午夜福利视频| 成人美女网站在线观看视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 男女那种视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 精品人妻视频免费看| 日韩欧美免费精品| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产 一区 欧美 日韩| 国产成人一区二区在线| 成人国产一区最新在线观看| 深爱激情五月婷婷| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 香蕉av资源在线| 精品免费久久久久久久清纯| 久久精品国产亚洲av天美| 国产高潮美女av| 亚洲四区av| 看片在线看免费视频| 深夜a级毛片| 男插女下体视频免费在线播放| 国内精品久久久久精免费| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 真人一进一出gif抽搐免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品精品国产色婷婷| 直男gayav资源| 日本与韩国留学比较| 国产成人aa在线观看| 色综合色国产| 丰满的人妻完整版| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 69av精品久久久久久| 午夜精品一区二区三区免费看| 精品国产三级普通话版| 国产日本99.免费观看| 国产乱人视频| 成年人黄色毛片网站| 国产午夜精品论理片| 长腿黑丝高跟| av黄色大香蕉| www日本黄色视频网| x7x7x7水蜜桃| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美zozozo另类| 成人一区二区视频在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美三级亚洲精品| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美人与善性xxx| 丰满人妻一区二区三区视频av| 精品久久久久久久久久久久久| 久久人人精品亚洲av| 久久九九热精品免费| 婷婷亚洲欧美| 九色成人免费人妻av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 热99在线观看视频| x7x7x7水蜜桃| 久久香蕉精品热| 亚洲av熟女| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 精品一区二区免费观看| 51国产日韩欧美| 国产老妇女一区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人永久免费在线观看视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产综合懂色| 一进一出好大好爽视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 99视频精品全部免费 在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久久久久大精品| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品av视频在线免费观看| 免费看日本二区| 黄色一级大片看看| 91在线精品国自产拍蜜月| 成人综合一区亚洲| 婷婷六月久久综合丁香| 极品教师在线视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 丝袜美腿在线中文| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美日韩乱码在线| 亚洲性久久影院| 国产成人福利小说| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产私拍福利视频在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 日本 av在线| 亚洲图色成人| 亚洲av.av天堂| 免费看av在线观看网站| 我的老师免费观看完整版| 欧美成人一区二区免费高清观看| 内射极品少妇av片p| 九色成人免费人妻av| 亚洲人成网站高清观看| av中文乱码字幕在线| 久久久久性生活片| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久九九热精品免费| 欧美三级亚洲精品| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 在线观看一区二区三区| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲精品在线观看二区| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲国产精品sss在线观看| 91精品国产九色| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲男人的天堂狠狠| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 校园春色视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品日产1卡2卡| 一区福利在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | h日本视频在线播放| 国产精品精品国产色婷婷| 99热精品在线国产| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 九色国产91popny在线| 少妇丰满av| 色尼玛亚洲综合影院| 他把我摸到了高潮在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 深夜a级毛片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲av.av天堂| 国产久久久一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 美女高潮的动态| av在线蜜桃| 精品人妻熟女av久视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 日本黄色视频三级网站网址| 俺也久久电影网| 亚洲电影在线观看av| 久久国内精品自在自线图片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲精华国产精华精| 国产精品久久久久久久电影| 午夜免费激情av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 99在线视频只有这里精品首页| 最近最新中文字幕大全电影3| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美日本视频| 69人妻影院| 欧美日韩综合久久久久久 | 成熟少妇高潮喷水视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 成人美女网站在线观看视频| 哪里可以看免费的av片| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲内射少妇av| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲av一区综合| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 在线天堂最新版资源| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产精品伦人一区二区| 国产高清激情床上av| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 夜夜夜夜夜久久久久| 少妇丰满av| 真实男女啪啪啪动态图| a级毛片a级免费在线|