5種微生態(tài)制劑對刺參幼參的生態(tài)安全性

劉鐵鋼,趙文,劉鋼,梁毅,孟文

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院 遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

近年來刺參養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為中國北方海水養(yǎng)殖的重要產(chǎn)業(yè)。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的提高，養(yǎng)殖水環(huán)境日益惡化，出現(xiàn)海參免疫力下降、生長緩慢、成活率低等一系列問題[1-3]。而在養(yǎng)殖過程中長期施用抗生素，不僅會導(dǎo)致動物機(jī)體的免疫力下降，而且還會因藥物殘留而危害食用者的健康[4-5]。微生態(tài)制劑是采用有益微生物經(jīng)特殊工藝制成的活菌制劑[6-8]，是一種綠色環(huán)保的純生物制劑，可以起到凈化水質(zhì)，對受到污染的水體進(jìn)行生態(tài)修復(fù)[9-12]，提高養(yǎng)殖對象的免疫力和生長率的作用[13-15]。因其具有良好的功效，能夠解決水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上一系列的問題，所以被大量使用。但微生態(tài)制劑對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生態(tài)安全性目前尚未見報(bào)道。本研究中，作者以刺參幼參為試驗(yàn)對象，采用微生態(tài)制劑，對幼參進(jìn)行耐受性、生長、免疫及水質(zhì)調(diào)控試驗(yàn)，旨在了解各種微生態(tài)制劑對刺參的半致死濃度、安全濃度和對刺參生長免疫及對養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響，為微生態(tài)制劑在刺參安全生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

刺參Apostichopusjaponicus購自大連莊河金砣水產(chǎn)食品有限公司，隨機(jī)抽取培育池中的幼參，選擇體態(tài)粗壯、伸展自然、疣刺尖挺、體褐色(混有少量青色)、攝食速度快、排便不黏而散的健壯幼參[16]，體質(zhì)量為2.0 g左右。試驗(yàn)飼料是由馬尾藻、鼠尾藻和海泥等主要原料制成的粉末狀飼料[13]。試驗(yàn)用海水取自大連市黑石礁海區(qū)，經(jīng)沉淀和砂濾處理后再用200目篩絹網(wǎng)過濾。選取上市成品微生態(tài)制劑5種，來自不同的生產(chǎn)廠家(表1)。超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)和過氧化物酶(POD)試劑盒均購自南京建成生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微生態(tài)制劑對幼參的急性毒性試驗(yàn) 挑選暫養(yǎng)7 d后大小均勻的健康幼參，投放在裝有60 L海水的PVC水箱中，每箱放幼參10頭。試驗(yàn)期間，不投喂飼料，靜水，不充氣，每24 h全量換水，換水后，重新添加微生態(tài)制劑，使之達(dá)到試驗(yàn)原始濃度。海水鹽度為33，pH為7.8～8.2，水溫為(15±1)℃。試驗(yàn)期間，每隔3 h(夜間除外)觀察一次刺參的活動情況，記錄死亡個(gè)數(shù)，并及時(shí)揀出死亡個(gè)體，以免污染試驗(yàn)水質(zhì)。幼參死亡的判定標(biāo)準(zhǔn)為：身體柔軟、自然卷曲，管足及觸手收縮回體內(nèi)，疣刺收縮，無附著能力，無活動及攝食能力，對輕微刺激無反應(yīng)[16-17]。通過預(yù)試驗(yàn)，將微生態(tài)制劑分別設(shè)4個(gè)濃度，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試劑一的濃度為1、2、3、4 g/L，試劑二的濃度為0.25、0.50、1.00、1.50 mL/L，試劑三的濃度為0.5、1.0、2.0、3.0 mL/L，試劑四的濃度為150、225、300、375 mg/L，試劑五的濃度為1.5、3.0、4.5、6.0 g/L，對照組不添加微生態(tài)制劑。

各試驗(yàn)組取重復(fù)平行結(jié)果的均值計(jì)算死亡率，按下面的公式進(jìn)行校正[15]：

P=(P′-C)/(1-C)，

式中：P′為試驗(yàn)組幼參死亡百分?jǐn)?shù)；C為對照組幼參死亡百分?jǐn)?shù)；P為經(jīng)校正后的試驗(yàn)組幼參死亡百分?jǐn)?shù)。半致死濃度(LC50)是指全組染毒或給藥后幼參半數(shù)死亡的濃度。以微生態(tài)制劑的濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)、幼參死亡率的概率單位為縱坐標(biāo)作曲線，并作線性回歸檢驗(yàn)，求其95%置信區(qū)間，確定48 h半致死濃度(LC50,48 h)和96 h半致死濃度(LC50,96 h)[18-19]。安全濃度(SC)是幼參能安全生活的最高濃度，一般用對應(yīng)的半致死濃度計(jì)算可得，計(jì)算公式[20]為

SC=96 h LC50×0.3/(48 h LC50/96 h LC50)2。

1.2.2 微生態(tài)制劑對幼參生長及其免疫酶的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)采用5種微生態(tài)制劑，分別設(shè)3個(gè)濃度，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每組放20頭幼參。試劑一的濃度為0.5、2.5、5.0 mg/L，試劑二的濃度為0.25、1.50、2.50 μL/L，試劑三的濃度為0.5、2.5、5.0 μL/L，試劑四的濃度為0.25、1.25、2.50 mg/L，試劑五的濃度為2、10、20 mg/L，對照組不添加微生態(tài)制劑。試驗(yàn)水體為60 L，海水鹽度為33±1，pH為7.6～8.3，水溫為(19±1) ℃。每日投餌率為幼參體質(zhì)量的10%。充氣，每3 d吸一次底，換水量為20%，換水后補(bǔ)加微生態(tài)制劑。30 d后結(jié)束試驗(yàn)，計(jì)算刺參的成活率、特定生長率，測量刺參體腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)及過氧化物酶(POD)的活性。各種酶的測定嚴(yán)格按試劑盒說明操作進(jìn)行。

特定生長率SGR=lnWt-lnW0t×100%,

其中：W0、Wt分別為試驗(yàn)初始和結(jié)束時(shí)刺參的體質(zhì)量(g);t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

體腔液的采集方法：采用1 mL一次性注射器，從刺參腹面近口身體1/3處(體腔)抽取體腔液0.1～0.2 mL，注入滅菌離心管中。

1.2.3 微生態(tài)制劑對幼參養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響試驗(yàn) 本試驗(yàn)中采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。試劑一至試劑五的濃度分別為5 mg/L、2.5 μL/L、5 μL/L、2.5 mg/L和20 mg/L，對照組不添加微生態(tài)制劑。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在60 L的PVC水箱中進(jìn)行，每箱投放20頭刺參，每日投餌量為幼參體質(zhì)量的5%。海水鹽度為33，pH為7.8～8.2，水溫為(16±1 )℃。

1)在靜水條件下每24 h監(jiān)測1次。在靜水、不換水、不充氣條件下，每24 h分別測定一次溶氧(DO)、氨態(tài)氮(NH+4-N)、亞硝酸鹽氮(NO-2-N)的含量，當(dāng)水中DO含量低于4 mg/L時(shí)結(jié)束試驗(yàn)。試驗(yàn)開始時(shí)添加一次微生態(tài)制劑，使之達(dá)到設(shè)計(jì)濃度。

2)在充氣條件下每隔5 d監(jiān)測1次。在充氧、不換水條件下，每隔5 d分別測定一次水中的NH+4-N、NO-2-N含量，并再次按原始濃度添加微生態(tài)制劑。當(dāng)水中的NH+4-N含量高于0.02 mg/L時(shí)結(jié)束試驗(yàn)。

采用碘量法測定DO，采用次溴酸鈉氧化法測定氨態(tài)氮，采用磺胺鹽酸奈乙二胺法測定亞硝酸鹽氮[21-22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，以0.05作為差異顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 微生態(tài)制劑對幼參的毒性

觀察發(fā)現(xiàn)：在不同種類和不同濃度的微生態(tài)制劑中，部分幼參身體出現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)，表現(xiàn)為身體收縮、活動能力下降、附著能力減弱，個(gè)別出現(xiàn)化皮，排臟現(xiàn)象較為嚴(yán)重；還有部分幼參死亡，死亡個(gè)體體色呈青色或黑青色，或者全身化皮、潰爛。試驗(yàn)期間，對照組幼參的成活率為100%。

從表2可見，隨著5種微生態(tài)制劑濃度的增加，幼參死亡率均逐漸升高。其中試劑一濃度為4 g/L時(shí)，幼參48 h和96 h的死亡率分別為(53±4.7)%和(83±4.7)%；試劑二濃度為1.50 mL/L時(shí)，幼參48 h和96 h的死亡率分別為(57±4.7)%和90%；試劑三濃度為3.0 mL/L時(shí)，幼參48 h和96 h的死亡率分別為(47±4.7)%和(93±4.7)%；試劑四濃度為375 mg/L時(shí)，幼參48 h和96 h的死亡率分別為(53±4.7)%和(80±8.2)%；試劑五濃度為6.0 g/L時(shí)，幼參48 h和96 h的死亡率分別為(47±4.7)%和(83±4.7)%。

表2 微生態(tài)制劑對幼參的急性毒性作用

根據(jù)表2作線性回歸分析，結(jié)果見表3。從表3可見，微生態(tài)試劑一對幼參的48 h、96 h LC50分別為4 074、2 041 mg/L，安全濃度為154 mg/L；試劑二對幼參的48 h、96 h LC50分別為1.41、0.51 mL/L，安全濃度為0.02 mL/L;試劑三對幼參的48 h、96 h LC50分別為3.4、1.0 mL/L，安全濃度為0.03 mL/L;試劑四對幼參的48 h、96 h LC50分別為389、246 mg/L，安全濃度為29.5 mg/L;試劑五對幼參的48 h、96 h LC50分別為6 920、3 548 mg/L，安全濃度為280 mg/L。5種微生態(tài)制劑對幼參的毒性順序?yàn)樵噭┒?試劑三>試劑四>試劑一>試劑五，試劑五對幼參的毒性最小，試劑二對幼參的毒性遠(yuǎn)強(qiáng)于其它各組。

表3 5種微生態(tài)制劑對幼參急性毒性作用的分析

2.2 微生態(tài)制劑對幼參生長及其酶活性的影響

2.2.1 微生態(tài)制劑對幼參生長的影響 在試驗(yàn)進(jìn)行30d后，各組成活率均為100%。5種微生態(tài)制劑對刺參幼參生長的影響以及各組特定生長率的相關(guān)性如表4所示。從表4可見，最大特定生長率出現(xiàn)在試劑一5mg/L處理組，為(1.58±0.07)%/d，最小值出現(xiàn)在對照組，為(1.26±0.05)%/d。就特定生長率而言，處理組均高于對照組；試劑一的中、高濃度組,試劑三的高濃度組,以及試劑四的中濃度組與對照組均存在顯著差異(P<0.05)；試劑一高濃度組與低濃度組間存在顯著差異(P<0.05)，其它處理組內(nèi)高、中、低濃度組之間差異均不顯著(P>0.05)。

2.2.2 微生態(tài)制劑對幼參酶活性的影響 從表4可見，添加微生態(tài)制劑組幼參的幾種酶的活性除試劑一0.5mg/L和試劑三0.5μL/LPOD組外均顯著高于對照組(P<0.05)。SOD、POD和LSZ酶活性最高值分別出現(xiàn)于試劑四的0.25mg/L組、試劑四0.25mg/L組和試劑三5μL/L組，其最高值分別為(78.89±0.3846)U/mL、(5.73±0.2400)U/mL、(6.79±0.0598)μg/mL。

試劑一各濃度組間的SOD、POD和LSZ活性差異均顯著(P<0.05)；試劑二各濃度組間的SOD和LSZ活性都有差異顯著(P<0.05)，高濃度組與中低濃度組的POD活性差異顯著(P<0.05)；試劑三各濃度組間的SOD、POD和LSZ活性均有顯著差異(P<0.05)；試劑四各濃度組間的SOD活性差異顯著(P<0.05)，低濃度組與中高濃度組的POD活性差異顯著(P<0.05)，高濃度組與中低濃度組的LSZ活性差異顯著(P<0.05)；試劑五低濃度組與中低濃度組的SOD活性差異顯著(P<0.05)，各濃度組間的POD活性差異顯著(P<0.05)，高濃度組與中低濃度組的LSZ活性差異顯著(P<0.05)。

2.3 微生態(tài)制劑對幼參養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響

2.3.1 靜水條件下水質(zhì)的變化 試驗(yàn)經(jīng)過48h結(jié)束，結(jié)束時(shí)測定試劑二至試劑五各處理組DO含量低于4mg/L。5種微生態(tài)制劑各處理組NH+4-N、NO-2-N、DO含量的調(diào)控結(jié)果見圖1和圖2。對照組NH+4-N和NO-2-N含量隨時(shí)間的增加而升高，與添加微生態(tài)制劑組(試劑二NH+4-N24h、試劑四NH+4-N48h組除外)差異均顯著(P<0.05)。而對照組DO含量隨時(shí)間的增加而降低，與添加微生態(tài)制劑組(試劑一48h組除外)差異均顯著(P<0.05)。24h時(shí)，添加微生態(tài)制劑組NH+4-N、NO-2-N含量降到最低點(diǎn)，試劑二和對照組NH+4-N含量差異不顯著，與其它各組差異顯著(P<0.05)；試劑二和試劑四間NO-2-N含量差異不顯著，與其它各組差異顯著(P<0.05)，試劑二DO含量與其它各組差異顯著(P<0.05)，試劑一、三、四和五組間DO含量差異不顯著。48h時(shí)，各組NH+4-N、NO-2-N含量上升(試劑四NH+4-N組除外)，試劑一和試劑二NO-2-N含量差異不顯著，與其它各組差異顯著(P<0.05)；DO含量繼續(xù)下降，試劑一DO含量和對照組差異不顯著，與其它各組差異顯著(P<0.05)，試劑三、四、五組間DO含量差異不顯著。

表4 微生態(tài)制劑對刺參生長、酶活性的影響

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

Note:The means with the different letters are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences.

2.3.2 充氣條件下水質(zhì)的變化 試驗(yàn)進(jìn)行第五次(第20天)測定時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩種微生態(tài)制劑組水體的NH+4-N含量已高于0.02 mg/L，其它各組的NH+4-N含量也接近0.02 mg/L，達(dá)到試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，故結(jié)束試驗(yàn)。

5種微生態(tài)制劑試驗(yàn)組水中NH+4-N和NO-2-N含量的測定結(jié)果見圖3。試驗(yàn)結(jié)果表明，第20天之前，各組NH+4-N和NO-2-N含量(NH+4-N組15 d除外)差異均不顯著(P>0.05)；第20天時(shí)，試劑一組和試劑四組的NH+4-N含量>0.02 mg/L，顯著高于其它組(P<0.05)；試劑四組和對照組的NO-2-N含量顯著高于其它組(P<0.05)。試驗(yàn)期間NO-2-N含量隨試驗(yàn)時(shí)間的延續(xù)而增高，對照組也有同樣趨勢。

3 討論

3.1 微生態(tài)制劑對幼參的急性毒性試驗(yàn)

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)，下同。Note:The means with the different letters are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia.圖1 微生態(tài)制劑對靜水中NH+4-N、NO-2-N含量的調(diào)控Fig.1 The control of NH+4-N， and NO-2-N in the static water by the probiotics

圖2 微生態(tài)制劑對靜水中DO含量的調(diào)控Fig.2 The control of DO in the water by the probiotics

隨著藥物濃度的提高和作用時(shí)間的延長，幼參死亡率逐漸增加，這與藥物的濃度大小、藥物的積累等因素有關(guān)。微生態(tài)制劑對幼參的半致死濃度均隨時(shí)間的增加而降低。研究證明，無脊椎動物的氧化殺菌機(jī)制是通過血細(xì)胞或體腔細(xì)胞吞噬活動中釋放出的活性氧進(jìn)行殺菌的，在吞噬過程中,活性氧的強(qiáng)弱直接反映了血細(xì)胞殺菌能力的強(qiáng)弱[23-24]。體內(nèi)累積的微生態(tài)制劑不斷消耗活性氧，從而降低機(jī)體的免疫力，增加死亡幾率。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，5種微生態(tài)制劑對幼參的48 h LC50、96 h LC50和SC遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+、Hg2+、Se4+等的濃度[25-26]；與常用的抗菌素、消毒劑和除草劑相比，試劑一和試劑四的毒性與之相似，而其它三種微生態(tài)制劑的毒性要遠(yuǎn)小于它們[15,17,27]。高濃度下的微生態(tài)制劑能夠刺激并導(dǎo)致幼參的細(xì)胞脫水收縮，也能造成幼參的急性致死。幼參在高濃度微生態(tài)制劑的作用下會出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，參體收縮，體表黏液分泌增多，出現(xiàn)局部潰爛或水皰狀突起，中毒個(gè)體活性減弱，嚴(yán)重者死亡；或死亡個(gè)體急劇收縮成團(tuán)，身體僵硬。有資料表明，刺參消化道中細(xì)菌數(shù)量可達(dá)1×107個(gè)/mL而不導(dǎo)致疾病[28]，微生態(tài)制劑對刺參致死，消化道細(xì)菌過量也可能是一個(gè)原因。

圖3 微生態(tài)制劑對充氣水中NH+4-N、NO-2-N的含量的調(diào)控Fig.3 The control of NH+4-N， and NO-2-N in the areated water by the probiotics

安全濃度是在毒性試驗(yàn)中對試驗(yàn)動物無影響的毒物濃度，在生物體內(nèi)一般僅能理解為相對意義上的安全。通過上述試驗(yàn)，得出了5種微生態(tài)制劑的安全濃度，其中試劑五(固態(tài)型)最為安全，其安全濃度為280 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生產(chǎn)上的使用量(生產(chǎn)中該試劑一般使用量為0.25～0.50 mg/L)。因此，從安全性來說，該種微生態(tài)制劑是比較理想的生物制劑，可以用于刺參生產(chǎn)中。固態(tài)微生態(tài)制劑需要水溶劑，必須溶于水中或與飼料混拌才起作用，故相應(yīng)的安全濃度要高于液態(tài)微生態(tài)制劑。本試驗(yàn)結(jié)果表明，液態(tài)微生態(tài)制劑的毒性要大于固態(tài)微生態(tài)制劑。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，刺參出現(xiàn)嚴(yán)重不適癥狀(化皮，明顯的表皮損傷，身體彎曲，成團(tuán))，試驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)更換新鮮海水，部分刺參可重新恢復(fù)活力，這一現(xiàn)象與周瑋等[27]的研究結(jié)果一致。更換新鮮海水后刺參雖然存活，但是否對其各項(xiàng)生長指標(biāo)產(chǎn)生不良影響，該影響日后能否消除，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 微生態(tài)制劑對幼參生長和酶活性的影響

本試驗(yàn)中僅在宏觀上研究了微生態(tài)制劑對刺參生長和酶活性的影響。許多研究結(jié)果表明，飼料中添加微生態(tài)制劑可以不同程度地提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的消化酶活性，提高成活率，促進(jìn)其生長[29-31]。袁成玉等[14]的研究表明，隨著腸道中的有益菌逐漸占優(yōu)勢，刺參在微生態(tài)平衡系統(tǒng)下生長速度加快。這說明微生態(tài)制劑的作用就在于能改善養(yǎng)殖動物腸道環(huán)境，使有益菌種成為腸道中的優(yōu)勢種，從而促進(jìn)機(jī)體吸收較多營養(yǎng)物質(zhì)，提高動物的消化率，促進(jìn)其生長。微生態(tài)制劑對刺參幼體的特定生長率為4～6 %/d[14]，而本試驗(yàn)中幼參的特定生長率為1～2 %/d，明顯偏低?？赡苁且?yàn)楸驹囼?yàn)中所用的微生態(tài)制劑均是以改善水質(zhì)環(huán)境為主的。張新明等[32]認(rèn)為，微生態(tài)制劑本身含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)隨著它們在動物消化道內(nèi)的繁衍、代謝，可產(chǎn)生動物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)、生長素、消化酶、各種B族維生素，從而加強(qiáng)動物的營養(yǎng)代謝，協(xié)助消化餌料，促進(jìn)生長；微生態(tài)制劑可通過競爭抑制以及產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式抑制有害細(xì)菌，改善對蝦的生存環(huán)境，從而促進(jìn)對蝦的生長。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，5種微生態(tài)制劑都能顯著提高幼參的SOD、LSZ、POD活性，驗(yàn)證了刺參生長與免疫酶活性之間有一定的正向關(guān)系[33]，但酶活性達(dá)最大值的試驗(yàn)組其特定生長率并沒有達(dá)到最大，說明添加微生態(tài)制劑并不是促進(jìn)刺參生長的唯一手段。本試驗(yàn)中采用的微生態(tài)制劑都含有芽孢桿菌，而芽孢桿菌可以提高消化酶活性，增加機(jī)體對養(yǎng)分的消化利用，提高飼料轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而促進(jìn)生長。因此，酶活性變化可以作為營養(yǎng)狀態(tài)指標(biāo)來指導(dǎo)刺參養(yǎng)殖，改善飼養(yǎng)效果[34]。此外，微生態(tài)制劑與腸道固有微生物菌群之間以及投喂菌群之間的作用關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

3.3 微生態(tài)制劑對幼參養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響

本試驗(yàn)中，在靜水且不換水的條件下，最初微生態(tài)制劑能夠降解刺參的代謝產(chǎn)物和水體中的殘餌，使NO-2-N和NH+4-N含量都降低。但微生態(tài)制劑同樣耗氧，DO若得不到補(bǔ)充(池塘水體有浮游生物微循環(huán))，隨著時(shí)間的延長，微生態(tài)制劑凈化水質(zhì)的能力下降，水體中代謝產(chǎn)物和殘餌逐漸增多，導(dǎo)致水體中NO-2-N和NH+4-N含量升高，溶氧持續(xù)降低，并達(dá)到臨界點(diǎn)。這可能是該試驗(yàn)中微生態(tài)制劑沒有達(dá)到良好凈化水質(zhì)的原因。從本試驗(yàn)結(jié)果可知，24 h前，NO-2-N和NH+4-N含量都降低，尤其對降低NO-2-N的效果十分顯著。這說明微生態(tài)制劑還是能夠起到凈化水質(zhì)的作用，從而也驗(yàn)證了Wang[35]的研究結(jié)果。5種微生態(tài)制劑中都含有芽孢桿菌，芽孢桿菌能夠促進(jìn)底泥下層需氧異養(yǎng)細(xì)菌(包括弧菌)的生長，加快底泥物質(zhì)和能量的代謝及再循環(huán)，有利于養(yǎng)殖環(huán)境的自我凈化[36]。沈南南等[37]的研究表明，小球藻和芽孢桿菌聯(lián)合使用，明顯優(yōu)于單一成分。陳海敏等[38]的研究也表明，光合細(xì)菌和小球藻聯(lián)合使用能很好的去除水體中的氮和磷，尤其對氨氮的去除效果最好。

試驗(yàn)期間，微生態(tài)制劑對水體的凈化能力并沒有隨時(shí)間的增加而呈規(guī)律性變化，與對照組差異不顯著。其原因可能是，在溶氧充足的條件下(試驗(yàn)期間DO>7 mg/L)，氧可以促進(jìn)亞鹽硝酸鹽的轉(zhuǎn)化[39]，故微生態(tài)制劑的作用不明顯，而且本試驗(yàn)又是在室內(nèi)條件下完成的，微生態(tài)制劑單一的作用也不明顯。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙文.刺參池塘養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)及健康養(yǎng)殖理論[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[2] 隋錫林，鄧歡.刺參池塘養(yǎng)殖的病害及防治對策[J].水產(chǎn)科學(xué)，2004，23(6)：22-24.

[3] 鄒積波，高廣斌，姜洪亮，等.分析刺參養(yǎng)殖發(fā)病原因、研討對策，走可持續(xù)發(fā)展之路[J].水產(chǎn)科學(xué)，2006，25(1):53-54.

[4] Parker R B.Probiotics-The other half of the antibiotics story[J].Anita Nutr Heal，1974，29：4-8.

[5] Zheng T L.The contribution of some marine microorganisms in the decontamination of shellfish[J].Revue Internationale Oceanographice Medicale，1989，94：1-14.

[6] 許振英，張子儀.動物營養(yǎng)研究進(jìn)展[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994：239-249.

[7] Kozasa M.Toyocerin(Bacillustoyoi) as growth promoter for animal feeding[J]. Microbiol Aliment Nutr, 1986(4):121-135.

[8] Moriarty D J W.Control of luminous vibrio species in penaeid aquaculture ponds[J].Aquaculture,1998,164(1):351-358.

[9] 王彥波，查龍應(yīng)，許梓榮.微生態(tài)制劑改善對蝦池塘底質(zhì)的效果[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17(9)：1765-1767.

[10] 馮俊榮，陳營，付學(xué)軍，等.微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體水質(zhì)條件的影響[J].海洋湖沼通報(bào)，2005(4)：104-108.

[11] 王志敏,張文香,張衛(wèi)國，等.在循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加微生態(tài)制劑去除氨氮和亞硝酸氮的實(shí)驗(yàn)[J].水產(chǎn)科學(xué),2006,25(4):17-21.

[12] 王彥波，鄧岳松.微生態(tài)制劑對蝦池水質(zhì)影響的研究[J].水利漁業(yè)，2003，23(2)：16-17.

[13] Soderhall K.Biochemical and molecular aspects of cellular communication in arthropods[J].Boll Zool,1992，59(2):141-151.

[14] 袁成玉,張洪,吳垠，等.微生態(tài)制劑對幼刺參生長及消化酶活性的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2006，25(12)：612-615.

[15] 嚴(yán)正凜.微生態(tài)制劑對九孔鮑育苗效果的研究[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2008，21(1)：21-25.

[16] 呂豪,周伯文.四種藥物對刺參幼參毒性的初步研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2005，24(6)：6-9.

[17] 李強(qiáng),羅永成,李華，等.常用抗菌藥物和消毒劑對刺參幼體的急性毒性試驗(yàn)[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(2)：105-110.

[18] 沈建忠. 動物毒理學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2004:83-87.

[19] 周永欣，章宗涉.水生生物毒性試驗(yàn)方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版杜，1989：75-156.

[20] 湖南醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生教研組.衛(wèi)生毒理實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1979：174-176.

[21] 國家環(huán)境保護(hù)局《水生生物檢測手冊》編輯委員會.水生生物檢測手冊[M].南京：東南大學(xué)出版社，1993：112-115.

[22] 雷衍之.養(yǎng)殖水環(huán)境化學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[23] Weleh W D，Devlin P.Analysis and comparison of the luminal-depended Chemiluminescence response of alveolar macrophages and neutrophils[J].Reticuloendothel Soc，1980，28：273-283.

[24] Horan T D，English D，Mcpherson T A.Association of neutrophil chemiluminescence with microbicidal activity[J].Clin Immunol Immunophathol，1982，22：259-269.

[25] 孫振興，陳書秀，陳靜，等.四種重金屬對刺參幼參的急性致毒效應(yīng)[J].海洋通報(bào)，2007，26(5)：80-85.

[26] 孫振興，王慧恩，王晶，等.汞、鎘、硒對刺參(Apostichopusjaponicus)幼參的單一毒性與聯(lián)合毒性[J].海洋與湖沼，2009，40(2)：228-234.

[27] 周瑋，夏念麗，劉永興，等.刺參對幾種除草劑的急性毒性試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科學(xué)，2005，24(5)：28-30.

[28] Fletcher T C.Non-specific defense mechanisms of fish [J].Developmental and Comparative Immunology Supp, 1982, 10(2): 123-132.

[29] Pan K C，Yang H B.Progress in study of mechanism ofBacillus[J].Feed Industry, 1997, 18(9):32-34.

[30] 田維熙，陳俊芹，黃莉莉，等.光合細(xì)菌在對蝦養(yǎng)殖中應(yīng)用效果的研究[J].飼料研究，1995(8)：4-6.

[31] 孫奕，陳瑪.刺參體內(nèi)外微生物組成及其生理特征的研究[J].海洋與湖沼，1989,20(4):300-307.

[32] 張新明，付寧.微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦促生長作用試驗(yàn)[J].水利漁業(yè)，2006，26(4)：38-39.

[33] Horan T D，English D，Mcpherson T A.Association of neutrophil chemiluminescence with microbicidal activity[J].Clin Immunol Immunophathol，1982，22：259.

[34] 王彥波，許梓榮，鄧岳松.微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的作用機(jī)理研究[J].中國飼料，2004(3):31-32.

[35] Wang Xianghong.Use of probiotics in aquaculture[J].Hjgh Technology Letters，2002，8(3)：22-27.

[36] 楊艷，劉萍，馬鵬飛，等.巨大芽孢桿菌MPF-906對養(yǎng)魚水質(zhì)凈化的初步研究[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2007，28(3)：6-8.

[37] 沈南南，李純厚，賈曉平，等.小球藻與芽孢桿菌對對蝦養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控的研究[J].海洋水產(chǎn)研究，2008，29(2)：48-50.

[38] 陳海敏，陳聲明.工廠化水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水菌藻聯(lián)合處理模式研究[J].浙江樹人大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，2(4)：64-66.

[39] 張進(jìn)鳳，李瑞偉，劉杰鳳，等.淡水養(yǎng)殖水體氨氮積累危害及生物控制的研究現(xiàn)狀[J].河北漁業(yè)，2009(6)：41-44.