西伯利亞鱘熱休克蛋白HSP70 cDNA的克隆、序列分析和組織分布

田照輝，徐紹剛，王巍，胡紅霞，董穎，宋超

(國家淡水漁業(yè)研究中心暨北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068)

熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)又稱應(yīng)激蛋白，其中HSP70家族高度保守，當(dāng)機(jī)體遭受應(yīng)激后會(huì)被誘導(dǎo)而迅速表達(dá)。HSP70具有分子伴侶功能，可以提高機(jī)體對(duì)應(yīng)激因子的抵抗能力，在免疫過程中具有重要作用[1-6]。熱休克蛋白因具有廣泛的生物學(xué)功能而成為研究熱點(diǎn)。一些學(xué)者對(duì)黃顙魚、團(tuán)頭魴、劍尾魚等多種魚類的HSP70基因進(jìn)行了克隆和研究[5-9]，還有學(xué)者建議將HSP70的表達(dá)作為潛在性的環(huán)境應(yīng)激和毒性量化指標(biāo)[10]。

西伯利亞鱘Acipenserbaerii屬鱘形目、鱘科、鱘屬,為亞冷水性魚類。該魚的養(yǎng)殖利潤(rùn)較高，因而成魚養(yǎng)殖得到迅速推廣。在成魚養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖戶的盲目選址以及為追求產(chǎn)量加大鱘的放養(yǎng)密度，由此而引起的擁擠脅迫和夏季水溫過高引起的高溫脅迫時(shí)有發(fā)生，致使西伯利亞鱘抗病力下降，病害增加。本研究中，作者首次克隆了西伯利亞鱘HSP70 cDNA的全長(zhǎng)，并對(duì)其在各組織中的分布進(jìn)行了分析，旨在為研究HSP70在西伯利亞鱘抗應(yīng)激過程中的作用和機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用西伯利亞鱘取自北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所國家級(jí)鱘魚良種場(chǎng)， 其中1尾(150 g)用于基因克隆試驗(yàn)，3尾(165 g±23.46 g)用于組織分布試驗(yàn)。

RNeasy mini kit提取試劑盒和RNase-Free DNase Set為Qiagen公司產(chǎn)品；Trizol Reagent、DNaseI、RT-PCR試劑盒購于Invitrogen公司；ExTaq、SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)和pGM-19T Vector載體連接試劑盒購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)定量試劑為AB公司生產(chǎn)的2×Sybrgreen PCR Master Mix?？寺【闐H10B由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所生物技術(shù)與育種研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物合成及測(cè)序 所有引物用Primer 5.0設(shè)計(jì)(表1)，其中中間片段引物HSPFP1、HSPRP2根據(jù)GenBank中登錄的白鱘、鯉、斑馬魚、鮭的HSP70基因保守區(qū)設(shè)計(jì)，其中3′HSP1、3′HSP2為3′RACE特異引物，5′GSP1為5′RACE特異引物，2010722F和2010722R為克隆OFR引物，4f和4r為實(shí)時(shí)定量引物。所有引物合成及序列測(cè)定均由北京擎科生物工程有限公司完成。

表1 試驗(yàn)用引物

1.2.2 HSP70 cDNA全長(zhǎng)序列的獲取

1)總RNA的提取。取1尾西伯利亞鱘(150 g)于水溫為24 ℃的水池中暫養(yǎng)1周，再轉(zhuǎn)入水溫為30 ℃的水池中急性熱應(yīng)激1.5 h。取其肝臟，用Trizol法提取總RNA，用BIORAD紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和OD值，根據(jù)OD260nm/OD280nm值和瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA的質(zhì)量。

2)合成cDNA第一鏈。用Dnase I處理總RNA，按照SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)使用說明，以O(shè)ligo(dT)20為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。

3)中間片段的分離。以cDNA第一鏈為模板，根據(jù)GenBank中登錄的HSP70保守區(qū)設(shè)計(jì)引物HSPFP1和HSPRP2擴(kuò)增西伯利亞鱘HSP70中間片段。PCR反應(yīng)體系包括10×buffer 2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、10 μmol/L引物各0.8 μL、5 U/μL ExTaq 0.2 μL、模板2.0 μL，加滅菌ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下變性45 s，55 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸2 min,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用Axygen膠回收試劑盒回收，連接pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化至DH10B大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑菌篩選。挑取單個(gè)白色菌落過夜培養(yǎng)，通過菌液鑒定挑選陽性菌液進(jìn)行測(cè)序。

4)3′端和5′端擴(kuò)增。3′HSP1、3′HSP2為根據(jù)中間片段序列設(shè)計(jì)的3′端特異性引物，其中3′HSP2為嵌套引物，AP和AUAP為非特異性引物。第一輪PCR反應(yīng)以cDNA第一鏈為模板，利用3′HSP1和錨定引物AP進(jìn)行擴(kuò)增；第二輪以第一輪產(chǎn)物為模板，以3′HSP2和AUAP為引物，進(jìn)行巣式PCR得到特異性單一片段。使用Clontech Race試劑盒對(duì)5′RACE進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收，連接轉(zhuǎn)化，進(jìn)行藍(lán)白斑菌篩選和菌液鑒定，對(duì)陽性菌液進(jìn)行測(cè)序。

5)HSP70 cDNA全長(zhǎng)序列的確定。使用DNAStar中的SeqManⅡ?qū)⑸鲜鲋虚g片段、3′端和5′端片段拼接成完整的西伯利亞鱘HSP70 cDNA序列。為驗(yàn)證全長(zhǎng)拼接的準(zhǔn)確性，在OFR兩端設(shè)計(jì)引物2010722F和2010722R，克隆接近OFR的長(zhǎng)片段，并與全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)。

6)序列分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建以及蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。使用軟件DNAstar、ClustalX 1.83、Mega 4、Antheprot 2000以及在線軟件SignalP完成。

1.2.3 HSP70 mRNA的組織分布

1)取樣。取體質(zhì)量為(165±23.46)g(n=3)的西伯利亞鱘于17.5 ℃水中暫養(yǎng)一周，試驗(yàn)時(shí)轉(zhuǎn)入含1 g/L丁香酚的水中，迅速麻醉后取其肝臟、鰓、脾臟、心臟、肌肉、中腸、性腺、腦8種組織，于液氮中速凍，-80 ℃下保存。

2)RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄。使用Qiagen公司生產(chǎn)的 RNeasy mini kit試劑盒提取總RNA，在RNase-Free DNase set柱上處理基因組，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD值，保證總RNA樣本的OD260 nm/OD280nm值為1.9～2.0，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA的完整性。

3)熒光實(shí)時(shí)定量。采用SYBR Green法，將待測(cè)樣品cDNA經(jīng)過系列稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線[10-12]。具體步驟如下：取總RNA 1 μg，用SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行無反轉(zhuǎn)錄酶(NRT)和無RNA(NOT)對(duì)照。實(shí)時(shí)定量引物4f、4r的擴(kuò)增片段為100 bp，預(yù)先采用普通PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證引物的特異性。實(shí)時(shí)定量時(shí)取1尾魚8種組織的cDNA等量混合，梯度稀釋30～36倍為模板，假定稀釋36倍的模板的copy值為1，作相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各組織的cDNA稀釋16.3倍作為模板，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)定量分析，并與NTC(無模板陰性對(duì)照)、NRT、NOT進(jìn)行對(duì)照。反應(yīng)總體積為20 μL，包括2×Sybrgreen PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L 4f、4r各0.7 μL，模板2 μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃下預(yù)變性10 min；95 ℃下變性15 s，58 ℃下退火15 s，72 ℃下延伸45 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，并采集熒光信號(hào)。每個(gè)模板重復(fù)3次，實(shí)時(shí)定量結(jié)束后立即進(jìn)行熔解曲線分析，熔解曲線從55 ℃到95 ℃，每30 s升高0.5 ℃，采集熒光15 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行處理，用One-Way進(jìn)行單因素方差分析，如果差異顯著則用Ducan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA

分離制備的總RNA的OD260 nm/OD280nm值為1.9～2.0，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28S、18S rRNA條帶清晰(圖1)，說明提取的RNA質(zhì)量很好，較完整，適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2.2 HSP70 cDNA全長(zhǎng)

用引物HSPFP1、HSPRP2擴(kuò)增的中間片段經(jīng)克隆后測(cè)序得到1 182 bp片段，3′RACE經(jīng)克隆后測(cè)序?yàn)?23 bp，5′RACE經(jīng)克隆后測(cè)序?yàn)?30 bp(圖1)。將上述中間片段、3′和5′序列使用DNAStar軟件中的SeqManⅡ拼接得到西伯利亞鱘HSP70 cDNA序列全長(zhǎng)為2 343 bp，該序列已登錄GenBank(登錄號(hào)為HM348777)。用引物2010722F和2010722R擴(kuò)增OFR得到的片段為1 958 bp，與設(shè)計(jì)片段比對(duì)，除幾處突變外完全一致。

2.3 序列分析

西伯利亞鱘HSP70 cDNA的全序列為2 343 bp，通過DNAstar軟件中的Editseq分析，5′非編碼區(qū)為140 bp，3′非編碼區(qū)為256 bp，具有AATAA的加尾信號(hào)及多聚A尾?？勺x編碼框(ORF)為1 947 bp，編碼為648個(gè)氨基酸。氨基酸殘基中，負(fù)電荷殘基(D,E)為96個(gè)，正電荷殘基(K,R)為81個(gè)，親水性殘基(A,I,L,F,W,V) 為209個(gè)，極性殘基(N,C,Q,S,T,Y)為 161個(gè)，整個(gè)蛋白帶負(fù)電荷-13.960(pH 7.0)，相對(duì)分子質(zhì)量為71 000，等電點(diǎn)為5.21，具有細(xì)胞質(zhì)特征性保守序列EEVD(645～648aa)，C端重復(fù)序列為GGMP(617～624 aa)。使用Antheprot 2000搜索到該序列中含有HSP70的3個(gè)特征序列(圖2)，分別為IDLGTTYS([IV]-D-L-G-T-[ST]-x-[SC], 11～18 aa)、IFDLGGGTFDVSIL([LIVMF]-[LIVMFY]-[DN]-[LIVMFS]-G-[GSH]-[GS]-[AST]-x(3)-[ST]-[LIVM]-[LIVMFC], 199～212 aa)和IVLVGGSTRIPKIQK([LIVMY]-x-[LIVMF]-x-G-G-x-[ST]-{LS}-[LIVM]-P-x-[LIVM]-x-[DEQKRSTA]， 336～350aa)。KRKYKKDISDNKRAVRRL和RARFEEL為推測(cè)的熱休克蛋白核定位序列。

注：1為引物HSPFP1、 HSPRP2擴(kuò)增的中間片段；2為3′端；3為5′端；4為總RNA。Note:1，the fragments of the primers HSPFP1 and HSPRP2;2，the fragment of 3′ Race; 3，the fragment of 5′ Race; 4，the total RNA.圖1 西伯利亞鱘總RNA和HSP70 cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The amplification products of total RNA and HSP70 cDNA in Siberian sturgeon Acipenser baerri

2.4 同源性分析

在GenBank中選取部分魚類、兩棲類和爬行類動(dòng)物的氨基酸序列使用軟件ClustalX 1.83進(jìn)行比對(duì)，用Mega 4構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap驗(yàn)證重復(fù)1 000次(圖3)。從圖3可見，

圖2 西伯利亞鱘HSP70 cDNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig.2 The cDNA nucleotide sequence of HSP70 and the amino acids deduced in Siberian sturgeon Acipenser baerii

續(xù)圖2 西伯利亞鱘HSP70 cDNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列Cont.Fig.2 The cDNA nucleotide sequence of HSP70 and the amino acids deduced in Siberian sturgeon Acipenser baerii

圖3 西伯利亞鱘HSP70氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)Fig.3 Phylogenetic tree of HSP70 amino acid sequence in Siberian sturgeon(NJ method)

非洲爪蛙蟾、密西西比短吻鱷、美西螈與西伯利亞鱘的HSP70聚為一支，西伯利亞鱘和美西螈親緣關(guān)系較近。

2.5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

用DNAStar軟件中的Protean對(duì)西伯利亞鱘熱休克蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原位點(diǎn)和親水性等進(jìn)行預(yù)測(cè) (圖4)。經(jīng)Hydropathy-Kyte-Doolittle預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，親水性區(qū)域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于疏水性區(qū)域，說明該蛋白是親水性的。經(jīng)Antigenic-Jameson-Wolf預(yù)測(cè)潛在的蛋白質(zhì)抗原決定簇，發(fā)現(xiàn)該蛋白的抗原位點(diǎn)豐富，具有良好的抗原性。用Chou-Fasman方案預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋區(qū)占40.7%，β-折疊區(qū)占23.4%，轉(zhuǎn)角區(qū)占30.2%;用Gamier-Roboson方案預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋區(qū)占47.5%，β-折疊區(qū)占35.9%，轉(zhuǎn)角區(qū)占6.47%，無規(guī)則卷曲區(qū)占10.2%。兩種方案的預(yù)測(cè)結(jié)果均說明該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。利用信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具SignalP對(duì)西伯利亞鱘HSP70蛋白序列在線搜索，使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(NN)和隱馬科夫模型(HMM)進(jìn)行預(yù)測(cè)，NN預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白沒有信號(hào)肽位點(diǎn)；HMM預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該信號(hào)肽概率極低，無信號(hào)肽。

圖4 用DNAStar軟件預(yù)測(cè)西伯利亞鱘HSP70的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Predicted HSP70 secondary structure in Siberian sturgeon by DNAStar

2.6 西伯利亞鱘HSP70 mRNA的組織分布

實(shí)時(shí)定量時(shí)取1尾魚8種組織的cDNA等量混合，梯度稀釋30～36倍為模板，假定稀釋36倍的模板的copy值為1，作相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，儀器根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和各組織Ct值自動(dòng)給出copy值。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.3611，R2=0.9956，擴(kuò)增效率為98.4%，說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠。熔解曲線分析沒有雜峰，說明產(chǎn)物單一。NTC(無模板陰性對(duì)照)、無反轉(zhuǎn)錄酶(NRT)和無RNA(NOT)對(duì)照均無信號(hào)，表明試驗(yàn)過程沒有外源污染和基因組污染。本試驗(yàn)結(jié)果表明，水溫為17.5 ℃時(shí)，西伯利亞鱘肝臟、鰓、脾臟、心臟、肌肉、中腸、性腺、腦8種組織中均有HSP70表達(dá)(圖6)，其中脾臟中的表達(dá)量最高，鰓中的次之，肝臟中的最低。除心臟與性腺的表達(dá)量、中腸與腦的表達(dá)量之間差異不顯著外(P>0.05)，其余各組織中的表達(dá)量之間差異均顯著(P<0.05)。

圖5 實(shí)時(shí)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The Standard curve by Real-time PCR

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。Note:The means with the different letters are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters are not significant differences.圖6 西伯利亞鱘HSP70 mRNA的組織分布Fig.6 Relative expression of HSP70 mRNA in 8 tissues in Siberian sturgeon Acipenser baerii

3 討論

本研究中得到了西伯利亞鱘HSP70 cDNA的全序列，但由于熱休克蛋白家族成員眾多，保守性強(qiáng)，成員間有一定的堿基同源性，存在不同基因被錯(cuò)誤拼接的可能，所以又進(jìn)行了OFR克隆與設(shè)計(jì)片段的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)除幾處突變外完全一致，說明拼接的為同一序列。經(jīng)NCBI Blast測(cè)序，所得cDNA序列與其它生物的HSP70 cDNA序列具有較高的同源性，與牙鲆Paralichthysolivaceus的相似度為82%，與草魚Ctenopharyngodonidella的相似度為84%。GenBank中高首鱘Acipensertransmontanus(AY880255)、大西洋鱘Acipensersturio(EU816599)只有HSP70 cDNA片段，通過DNAssist比對(duì)與所得序列中間片段基本一致。所得序列全長(zhǎng)為2 343 bp，可讀編碼框(ORF)為1 947 bp，編碼為648個(gè)氨基酸。氨基酸序列分析結(jié)果表明，該序列中含有HSP70家族的3個(gè)特征序列——IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKIQK，所以得到的序列是HSP70 cDNA序列，序列C末端具有熱休克蛋白高度保守的細(xì)胞質(zhì)特異調(diào)控序列EEVD[7,9]，說明該蛋白是細(xì)胞質(zhì)熱休克蛋白。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白是親水性的，以α-螺旋為主，具有豐富的抗原位點(diǎn)，無信號(hào)肽位點(diǎn)。

熱休克蛋白家族中HSP70家族成員最多，包括兩種蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)型HSC70(Heat shock cognate protein 70)和誘導(dǎo)型HSP70(Heat shock protein 70)，這兩種蛋白質(zhì)的氨基酸序列90%相同，大部分特性也相同[13]。魚類與哺乳動(dòng)物、兩棲類非洲爪蛙蟾HSP70氨基酸序列相似度平均值分別為86.2%和86.8 %[14]，進(jìn)化較為保守。本研究中，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，牙鲆、斑馬魚和人熱休克蛋白各自的結(jié)構(gòu)型和誘導(dǎo)型聚成一支，西伯利亞鱘與非洲爪蛙蟾Xenopuslaevis、密西西比短吻鱷Alligatormississippiensis和美西螈Ambystomamexicanum聚為一支，與美西螈親緣關(guān)系最近，這與上述觀點(diǎn)相符。高宇等[14]認(rèn)為，雜交鱘Husohuso♀×Acipenserschrenck♂、匙吻鱘與團(tuán)頭魴、鯽、鯉、斑馬魚聚為一個(gè)類群，和鯽的親緣關(guān)系最近，可能因?yàn)樗麄兪褂玫氖遣糠趾塑账嵝蛄袠?gòu)建的MP系統(tǒng)發(fā)育樹。

魚類結(jié)構(gòu)型HSC70基因具有內(nèi)含子，而誘導(dǎo)型HSP70基因沒有內(nèi)含子[2, 15];誘導(dǎo)型HSP70在正常細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)量很少，在應(yīng)激條件下表達(dá)量迅速增高，而結(jié)構(gòu)型熱休克蛋白在所有細(xì)胞中均有表達(dá)[16]。本研究中，克隆的HSP70在8種組織中都有一定的基礎(chǔ)表達(dá)，符合結(jié)構(gòu)型的表達(dá)特征。試驗(yàn)中用丁香酚迅速將魚麻醉后取樣，避免了因操作而引起的應(yīng)激。丁香酚對(duì)西伯利亞鱘稚魚耗氧率和幼魚生化指標(biāo)能產(chǎn)生一定的影響[17]，但能否誘導(dǎo)西伯利亞鱘熱休克蛋白的表達(dá)尚未見報(bào)道。

Deane等[18]對(duì)熱休克蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，認(rèn)為銀鯛Sparussarba結(jié)構(gòu)型HSP70有多個(gè)GGXP模體和九肽模體SGPTIEEVD，誘導(dǎo)型HSP70多數(shù)情況只出現(xiàn)一次GGXP，九肽結(jié)構(gòu)也不同于結(jié)構(gòu)型的SGPTIEEVD。這與明建華等[7]對(duì)團(tuán)頭魴Megalobramaamblycephala和Cui等[19]對(duì)三疣梭子蟹Portunustrituberculatus的熱休克蛋白基因克隆結(jié)果相同。本研究中，克隆的HSP70氨基酸序列中GGMP重復(fù)兩次，并含有九肽模體SGPTIEEVD，按照Deane等[18]的觀點(diǎn)應(yīng)為結(jié)構(gòu)型HSC70。但是人的誘導(dǎo)型熱休克蛋白HSP701A/1B中具有SGPTIEEVD九肽結(jié)構(gòu)模體(NP_005336.3)，而結(jié)構(gòu)型HSP701-Like(NP_005518.3)中卻無此九肽結(jié)構(gòu)[20]；非洲爪蛙蟾Xenopuslaevis誘導(dǎo)型HSP70 1B(NP_001091238.1)中也含有九肽模體SGPTIEEVD和重復(fù)的GGMP[21]。這與Deane等[18]的結(jié)論不一致。

目前對(duì)鱘熱休克蛋白的研究較少，僅有部分學(xué)者使用免疫印跡法對(duì)其它魚類的熱休克蛋白進(jìn)行了研究[22-24]。中吻鱘Acipensermedirostris仔魚受到熱應(yīng)激后，會(huì)導(dǎo)致畸形個(gè)體和正常個(gè)體中HSP72 和HSP78的表達(dá)量持續(xù)升高，HSP60表達(dá)水平可能與仔魚熱應(yīng)激易損性相關(guān)[23]。投飼率和溫度均能引起高首鱘Acipensertransmontanus熱休克蛋白的變化，且HSP70的上升幅度較HSP60更為明顯，因而HSP70是更靈敏的生物學(xué)指標(biāo)[24]。鱘屬于亞冷性魚類，水溫是非常重要的脅迫因子[22,24]。研究表明，魚類經(jīng)過長(zhǎng)期的高溫馴化可以改變其機(jī)體內(nèi)HSP70的表達(dá)機(jī)制[25]。所以研究西伯利亞鱘在不同生態(tài)環(huán)境中HSP70 cDNA的表達(dá)，有助于在分子水平上研究西伯利亞鱘的抗逆機(jī)理。本研究中克隆了西伯利亞鱘HSP70的cDNA序列，通過實(shí)時(shí)定量，得到了其在各組織中的分布情況，其中脾臟中的表達(dá)量最高，鰓中的表達(dá)量次之，肝臟中的表達(dá)量最低(P<0.05)，因此，HSP70表達(dá)量較高的組織可用于監(jiān)測(cè)西伯利亞鱘的應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)。

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