氯化銨對(duì)順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究

張 遠(yuǎn)田 慧王 寧丁 艷賴(lài)一鳴陳曉杰徐 冶

1.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室,吉林 吉林 132013

氯化銨對(duì)順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究

張 遠(yuǎn)1田 慧1王 寧1丁 艷1賴(lài)一鳴1陳曉杰1徐 冶2

1.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室,吉林 吉林 132013

目的探討氯化銨（NH4CL）對(duì)順鉑（cisplatin，CDDP）抑制A549細(xì)胞增殖的影響。方法體外培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞，MTT法檢測(cè)NH4CL及CDDP對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖率的影響；光鏡下觀察NH4CL及CDDP對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；共聚焦顯微鏡下觀察A549細(xì)胞核的形態(tài)變化。結(jié)果與對(duì)照組相比，給予不同濃度的NH4CL及CDDP導(dǎo)致A549細(xì)胞增殖率明顯下降；光鏡下觀察A549細(xì)胞經(jīng)非毒性劑量的NH4CL與CDDP聯(lián)合應(yīng)用處理后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制明顯高于單獨(dú)給予CDDP組；共聚焦顯微鏡觀察可見(jiàn)非毒性劑量的NH4CL與CDDP聯(lián)合應(yīng)用處理A549細(xì)胞核碎裂現(xiàn)象明顯多于單獨(dú)CDDP處理組。結(jié)論 NH4CL可以促進(jìn)CDDP對(duì)A549A細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

氯化銨;順鉑;肺癌;凋亡

順鉑（cisplatin，CDDP）是一種光譜有效的抗腫瘤藥物，對(duì)各種實(shí)體瘤均有顯著的臨床療效。對(duì)肺癌實(shí)施以順鉑為主的聯(lián)合化療方案的多學(xué)科綜合治療已經(jīng)取得了顯著的療效。已經(jīng)明確，肺癌化療可以延長(zhǎng)患者的生存期。然而，由于耐藥的發(fā)生，常導(dǎo)致肺癌化療的失敗，并限制了鉑類(lèi)藥物的廣泛使用。肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制復(fù)雜，涉及染色體和基因表達(dá)的異常及細(xì)胞外基質(zhì)密度異常有關(guān)[1]。為了尋找克服肺癌對(duì)順鉑的耐藥性，本文探討聯(lián)合使用NH4CL與CDDP共同作用肺癌A549細(xì)胞，觀察NH4CL對(duì)CDDP誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響，以尋找可能的治療線(xiàn)索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺癌細(xì)胞株A549由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系惠贈(zèng)，用含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3-（4，5-二甲基噻唑）-2，5-L苯基—四唑溴鹽（MTT），二甲基亞砜（DMSO），Hoechst33342，胰蛋白酶購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，0.25%胰酶消化后離心，按每孔含0.5×104個(gè)A549細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使A549細(xì)胞完全貼壁。設(shè)立單加培養(yǎng)液空白對(duì)照組和不加藥物陰性對(duì)照組以及不同藥物不同濃度實(shí)驗(yàn)組，以確定最適聯(lián)合用藥的藥物濃度。每組實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，CDDP組濃度為：0，0.00125，0.0025，0.005，0.01，0.02，0.04，0.08 mg/L；NH4CL組濃度為：0，0.5，1，2，5，10，20，40，80 mM；37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h和24 h后，每孔加入20 ul MTT，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入DMSO 200 ul，振蕩10分鐘后，酶標(biāo)讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值（OD值），美國(guó)伯樂(lè)公司Model680酶標(biāo)儀、測(cè)定波長(zhǎng)570 nm，分別計(jì)算不同濃度的CDDP及NH4CL對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1-(實(shí)驗(yàn)組OD值—空白組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況分4組即空白組、CDDP組、NH4CL組、NH4CL與CDDP聯(lián)合組。待A549細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁，CDDP組加入0.02 mg/ L的順鉑，NH4CL組加入2 mM NH4CL,聯(lián)合組先加2 mM的NH4CL作用一小時(shí)，再加入0.02 mg/L的CDDP，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，0.25%胰酶消化后離心，按每孔5×104個(gè)細(xì)胞加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞完全貼壁。分組及給藥方法同上（1.2.3），37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出24孔板，吸掉各孔液體，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定25 min，再用PBS洗3次。用0.1%TritonPBS作用5 min，再用PBS洗3次后，Hoetrest33342染色5 min，PBS洗3次，甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察取圖。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果 單獨(dú)使用不同濃度的CDDP對(duì)A549細(xì)胞有增殖抑制作用，細(xì)胞活力隨時(shí)間及劑量增加而降低。而不同濃度梯度的NH4CL對(duì)A549細(xì)胞作用24 h，高濃度的NH4CL對(duì)A549細(xì)胞株體外生長(zhǎng)有抑制作用，而2 mM以下無(wú)明顯毒性作用。見(jiàn)圖1、2。

圖1 順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞活力的影響Fig1 The vitality of A549 cells treated with cisplatin.

2.2 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) A549細(xì)胞給予CDDP(0.02 mg/L)、無(wú)毒性劑量(2 mM)的NH4CL及兩者聯(lián)合作用24h后，鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)給予CDDP組相比，兩藥合用對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，明顯強(qiáng)于單獨(dú)CDDP組。見(jiàn)圖3。

2.3 共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核變化 單獨(dú)給予CDDP組，可見(jiàn)部分細(xì)胞核碎裂，單獨(dú)給予NH4CL，細(xì)胞核形態(tài)基本正常；聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞核碎裂的細(xì)胞數(shù)明顯增多。見(jiàn)圖4。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組藥物對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）Fig3 The morphology of A549 cells treated with vary drugs of each experimental group.（100×）

圖4 各實(shí)驗(yàn)組藥物對(duì)A549細(xì)胞核形態(tài)的影響（Bar=10 μm）Fig4 The nuclear morphology of A549 cells treated with vary drugs of each experimental group.

3 討論

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于大多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期，喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，含鉑類(lèi)藥物的聯(lián)合化療方案已成為晚期肺癌的主要治療方法[2]。常規(guī)治療方案是在細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行以CDDP為主的聯(lián)合化療。CDDP是廣泛使用的化療藥物,但由于原發(fā)或繼發(fā)的多藥耐藥的存在, 嚴(yán)重影響了化療的療效及患者預(yù)后[3,4]。已有研究表明, 細(xì)胞CDDP耐藥的形成與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[5,6]。CDDP能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)形成大量泛素化的未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白,而細(xì)胞內(nèi)絕大部分聚集蛋白和大部分可溶性蛋白通過(guò)自噬途徑清除[7,8]。如果細(xì)胞內(nèi)堆積的錯(cuò)誤折疊蛋白不能及時(shí)清除, 就會(huì)引發(fā)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)加入NH4CL阻斷細(xì)胞溶酶體途徑，增加了順鉑的細(xì)胞殺傷作用，以期為順鉑聯(lián)合應(yīng)用提供新的參考。

綜上，NH4CL干預(yù)溶酶體功能，可以增加CDDP的細(xì)胞殺傷作用；其作用機(jī)制可能是NH4CL阻斷了錯(cuò)誤折疊蛋白的溶酶體降解途徑，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體途徑凋亡活化增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡增多。表明NH4CL能夠促進(jìn)CDDP誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用及具體機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Morphology Study of Ammonium chloride on A549 Apoptosis Induced by Cisplatin

Zhang Yuan1,Tian Hui1,Wang Ning1,Ding Yan1,Lai Yiming1,Chen Xiaojie1,Xu Ye2
1.Clinical Medicine College 2.Medical Scientific Research Lab Jilin City, Jilin Province 132013, China

R73-3

A

10.3969/j.issn.1001-8972.2012.19.057

由吉林省科技廳資助，編號(hào)201015240；吉林醫(yī)藥學(xué)院大學(xué)生科研基金資助，編號(hào)2011-01

徐冶，男，1972年出生，博士，副教授，研究方向：主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究。

AbstractAim: To investigate the effect of ammonium chloride (NH4CL) on the proliferation of A549 cells inhibited by cisplatin (CDDP).Methods: Culturing human lung adenocarcinoma A549 cell in vitro, conducting MTT assay for the effect on the proliferation rate of human lung adenocarcinoma A549 cells treated with NH4CL and CDDP; Observing the effect on the growth of A549 cells treated with NH4CL and /or CDDP under optical microscope; observing the morphological changes of the A549 cell nucleus under fluorescence confocal microscope.Results: compared with the control group, the proliferation rate of A549 cells dramatically decreased caused by NH4CL and CDDP with different concentration; under optical microscope, the inhibition of proliferation of A 549 cells collectively treated with nontoxic dose of NH4CL and CDDP was apparently higher than the group treated with CDDP only.Under fluorescence confocal microscope, nuclear fragmentation of A549 cells collectively treated with nontoxic dose of NH4CL and CDDP is significantly more than the group treated with CDDP only.

Conclusion: NH4CL can enhance CDDP induced the apoptosis of A549 cells.

Keywordsammonium chloride; cisplatin; lung cancer; apoptosis