抑制JAK/STAT信號通路對缺血再灌注大鼠心肌的影響

劉冬云 侯云生 王天軼 (白求恩國際和平醫(yī)院急診科，河北 石家莊 050082)

隨著急診溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)等再灌注治療的開展，心肌再灌注損傷已成為阻礙缺血心肌從再灌注治療中獲得最佳療效的主要難題。研究表明，Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)(JAK/STAT)信號通路與缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的心肌保護(hù)及缺血再灌注損傷(I/R)引起的心功能障礙密切相關(guān)〔1〕。但目前有關(guān)JAK-STAT信號通路在心肌I/R中的作用還有爭議。本課題擬研究抑制JAK/STAT信號通路對I/R大鼠心肌的影響，有助于從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平研究I/R損傷的發(fā)病機(jī)制，從而為臨床治療I/R損傷提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級Wistar雄性大鼠24只，體重250～300 kg，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購置，于清潔環(huán)境下自由飼養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組(C組)，開胸后以5-0無損傷縫線直接穿過冠狀動脈，不結(jié)扎;I/R組，建立I/R模型;JAK抑制劑——AG490(I/R+AG490)組，于 I/R前30 min腹腔注射AG 490(8 μg/g);STAT抑制劑——雷帕霉素(RMP)(I/R+RMP)組，I/R 前30 min腹腔注射 RMP(0.4 μg/g)。

1.1.2 主要試劑 兔抗JAK2多克隆抗體、兔抗STAT1多克隆抗體、兔抗STAT3多克隆抗體均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，兔抗p-JAK2多克隆抗體、兔抗p-STAT1多克隆抗體、兔抗p-STAT3多克隆抗體均為美國Cell Signaling公司產(chǎn)品，TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌I/R模型的建立 Wistar大鼠以90 mg/kg選用3%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉注射。固定大鼠，常規(guī)取材前準(zhǔn)備，并記錄全導(dǎo)心電圖，以潮氣量5 ml/100 g的小動物呼吸機(jī)輔助呼吸，造模過程中根據(jù)呼吸頻率、強(qiáng)度調(diào)整其參數(shù)，于胸骨左側(cè)約0.5 cm處、第3～5肋間切口，鈍性分離至肋間隙，剪斷第三、四肋，使得在胸腔暴露的情況下刺穿心包膜，用5-0無損傷縫線在左冠狀動脈前降支處穿過心肌表層，進(jìn)針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm，穩(wěn)定10 min后將一膠管(1.5～2.0 mm)平行置于冠狀動脈表面，連同硅膠管一起結(jié)扎冠狀動脈前降支，使膠管壓迫冠狀動脈造成心肌缺血，結(jié)扎。

模型成功標(biāo)準(zhǔn):全導(dǎo)心電圖示在心肌I/R過程中伴有ST段變化或QRS波增寬、增高，結(jié)扎線以下心肌顏色變暗，表示結(jié)扎成功。結(jié)扎30 min后，剪斷結(jié)扎線，拔除硅膠管，再灌注120 min。再灌注成功即心肌顏色變?yōu)轷r紅。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎，AG490組及RMP組于I/R前30 min分別注射AG490 8 mg/kg、RMP 0.4 mg/kg。

1.2.2 Western印跡檢測 采用常規(guī)方法進(jìn)行操作。再灌注結(jié)束后取出心臟，洗凈血跡，剪去右室及心房，用濾紙吸干，取左心室前壁液氮冷凍。從液氮罐中取出心肌組織置于勻漿器中，加入細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.02%NaN3，0.1%SDS，100 μg/ml PMSF，1 μg/ml抑酞酶，1%NP-40，0.5%去膽酸鈉)，置于冰上進(jìn)行勻漿，裂解30 min后即用移液器移置1.5 ml離心管中，12 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液置于－80℃保存。Lowry法測定總蛋白量，調(diào)蛋白質(zhì)濃度為200 μg?？偟牡鞍滋崛∥锝?jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，分別與抗JAK2、STAT1、STAT3多克隆抗體，抗pTyr-JAK2、抗pTyr-STAT1、抗pTyr-STST3共同孵育2 h，然后洗脫，封閉后加入1∶2 000的二抗(辣根酶記的羊抗兔IgG抗體)，室溫下雜交1 h，化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)，X光壓片曝光，漂洗后自顯影。用密度掃描儀測定條帶的密度(OD)，以光密度代表細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(EPK)蛋白的相對表達(dá)值。

1.2.3 組織切片制備 取出心臟，洗凈血跡，剪取右心室和心房，用濾紙吸干，置于4%多聚甲醛中固定24 h，從心尖始以間距0.3 cm橫向連續(xù)切片至冠狀動脈穿線處，石蠟包埋切片。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(原位末端標(biāo)記法，TUNEL) ①冰凍切片用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2 min，2次，蒸餾水洗2 min，2次;②3%的H2O2阻斷內(nèi)源性辣根過氧化物酶室溫處理10 min，蒸餾水洗;③每片加標(biāo)記緩沖液20 μl，以保持切片的濕潤，按每張切片取 TdT 和DIG-d-UTP各1 μl，加入18 μl標(biāo)記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標(biāo)記液。置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2 h;④0.01 mol/L Tris鹽酸緩沖液(TBS)，每片加封閉液50 μl，室溫30 min甩掉封閉液，不洗;⑤1∶100稀釋地高辛抗體，混勻后50 μl/片加至標(biāo)片上，置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng)30 s，0.01 mmol/L TBS沖洗;⑥用抗體稀釋液1∶100稀釋，生物素-鏈霉親合素-過氧化物酶法(SABC):取1 ml抗體稀釋液加 SABC 10 μl，混勻后 50 μl/片加至切片，37℃ 反應(yīng)30 s，0.01 mmol/L TBS洗;⑦二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、封片。每張切片拍攝5個視野，根據(jù)每個視野中心肌細(xì)胞陽性數(shù)量計算百分比，作為凋亡指數(shù)(AI)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料采用t檢驗(yàn)，以±s表示;計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Western印跡檢測結(jié)果 假手術(shù)組 p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3少量表達(dá);與假手術(shù)組比較，缺血再灌注后p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3表達(dá)明顯增加，且p-STAT1較p-STAT3的表達(dá)增加明顯;應(yīng)用 AG490后，p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3的表達(dá)減少;應(yīng)用RMP后p-JAK2、p-STAT1的表達(dá)無改變，p-STAT3的表達(dá)減少。見圖1。

2.2 心肌細(xì)胞凋亡檢測的結(jié)果 假手術(shù)組、I/R組、AG490組、RMP組 AI分別為4.25±2.04，12.58±1.35，7.36±1.30，13.32±1.58，組間比較差異顯著(P＜0.05)。

圖1 Western印跡檢測結(jié)果

3 討論

業(yè)已證實(shí)，胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑JAK/STAT信號通路主要將胞膜感受的信號直接傳遞到核內(nèi)，從而啟動基因轉(zhuǎn)錄，其中JAK是胞質(zhì)內(nèi)非受體型的一類可溶性酪氨酸蛋白激酶，已知有4 個亞型——JAK1、JAK2、JAK3 及 TYK2;而 STATS屬于人和哺乳動物共有的可與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的另外一類胞質(zhì)蛋白家 族，有 7 個 亞 型——STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6，上述兩種均可在心肌細(xì)胞表達(dá)。

有研究顯示，G蛋白耦聯(lián)的神經(jīng)激素(AngⅡ、腺苷、內(nèi)皮素等)、細(xì)胞因子(白介素、腫瘤壞死因子等)等胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過激活蛋白激酶JAK，進(jìn)而影響STATS磷酸化，產(chǎn)生心肌I/R，從而進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮生物效應(yīng)。據(jù)此推測，JAK-STAT信號通路可能參與了I/R過程。本研究成功建立了在體大鼠心肌I/R模型，發(fā)現(xiàn)缺血30 min再灌注120 min后，大鼠心肌磷酸化的JAK2、STAT1、STAT3數(shù)量都增高，同時磷酸化的STAT1數(shù)量遠(yuǎn)較磷酸化的STAT3多，凋亡的心肌細(xì)胞也明顯增多。于I/R前30 min給大鼠腹腔注射JAK2抑制劑AG490后 JAKs和STATs的活化被顯著抑制，凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量也明顯減少。于I/R前30 min給大鼠腹腔注射RMP對磷酸化的JAK2及STAT1數(shù)量沒有影響，但能抑制STAT3的磷酸化，使p-STAT1和p-STAT3的比例增高，同時凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量與I/R組相比增多。綜上所述，心肌I/R后JAK/STAT信號通路被激活，且STAT1和STAT3的激活對心肌具有相反的作用〔2，3〕，心肌缺血時伴有的細(xì)胞凋亡時STAT1表達(dá)增加、轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，而激活的STAT3不僅抑制心肌細(xì)胞凋亡，還能發(fā)揮心肌保護(hù)作用〔4〕。大鼠心肌I/R時，JAK/STAT通路的激活可能加重心肌損傷，而心肌損傷的程度可能與p-STAT1和p-STAT3的比例有關(guān)，p-STAT1和p-STAT3的比例越高，心肌損傷的程度可能越重。而AG490作為JAK2的特異性拮抗劑，可減少心肌梗死面積，降低細(xì)胞凋亡并促進(jìn)心功能的恢復(fù)〔5，6〕，從而能減輕I/R導(dǎo)致的心肌損傷。

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2 Boengler K，Buechert A，Heinen Y，et al.Cardioprotection by ischemic postconditioning is lost in aged and STAT3-deficient mice〔J〕.Circ Res，2008;102(1):131-5.

3 高美華，張 麗，李 冰，等.川穹嗪對AngⅡ誘導(dǎo)大鼠心肌肥大細(xì)胞JAK-STAT通路作用〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)，2011;27(5):519-22.

4 Barry SP，Townsend PA.Role of the JAK-STAT pathway in myocardial injury〔J〕.Trends Mol Med，2007;13(2):82-9.

5 Ng DCH，Court NW，dos Remedios CG，et al.Activation of signal transducer and activator of transcription(STAT)pathways in failing human hearts〔J〕.Cardiovasc Res，2003;57(2):333-46.

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