IFN-γ和caspase-3在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎病程中動(dòng)態(tài)表達(dá)及雷公藤多甙保護(hù)作用的探討

周發(fā)明， 魏麓云， 王世鳳， 趙 斌

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特征的自身免疫性疾病。目前MS的治療沒(méi)有針對(duì)MS早期病理上存在變性、壞死的軸突損害，療效預(yù)后差［1］。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究多發(fā)性硬化的經(jīng)典動(dòng)物模型。特異性T細(xì)胞增殖及其炎性因子的水平反映疾病的嚴(yán)重程度，IFN-γ是我們研究EAE的重要指標(biāo)。

研究表明［2］，EAE動(dòng)物模型中的脫髓鞘、神經(jīng)細(xì)胞凋亡與caspase有關(guān)。Caspase介導(dǎo)的凋亡與EAE的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)，運(yùn)用caspase抑制劑可減輕髓鞘損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮治療MS的作用［3］。雷公藤多甙已廣泛用于免疫性疾病的治療中，且還具有神經(jīng)保護(hù)功能。本實(shí)驗(yàn)擬探討雷公藤多甙對(duì)EAE作用的可能機(jī)制，為治療人類MS提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 卡介苗凍干粉，上海生物制品研究所;兔抗大鼠caspase-3多克隆抗體、兔抗大鼠IFN-γ多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司;雷公藤多甙片(TWP)，黃石飛云制藥有限公司(Z42021212)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 6～8周齡雌性Wistar大鼠60只(南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重約180～200g。將大鼠分成 4組:(1)正常組(CON組，n=15)，不做任何處理;(2)EAE+NS組(EAE組，n=15);(3)EAE+小劑量TWP組(TWP1組，n=15);(4)EAE+大劑量TWP組(TWP2組，n=15)。EAE組、TWP1組和TWP2組再分別按時(shí)間分為3個(gè)亞組，即7d組、14d組、21d組，每小組5只。分別于第7天、第14天、第21天(此時(shí)接近EAE模型發(fā)病的早期、高峰期、恢復(fù)期)處死，而正常組于第21天全部處死。CON組不做任何處理;EAE組以生理鹽水1.5ml/只灌胃，每天一次。大小劑量組分別按30mg/kg/d、10mg/kg/d劑量灌胃。于動(dòng)物免疫后第一天開(kāi)始，每日灌胃一次直至動(dòng)物處死。

1.3 動(dòng)物模型建立 將等量的豚鼠脊髓勻漿和含8mg/ml卡介苗的完全福氏佐劑完混合為免疫抗原，Wistar大鼠按0.5ml/只分別于大鼠后足墊及背部皮下注射免疫抗原，誘導(dǎo)EAE模型［4］。于動(dòng)物免疫后，每天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。采用Hooper的7分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，0分:正常;1分:被毛不光整，尾部無(wú)力;2分:尾部癱瘓;3分:尾部癱瘓+后肢無(wú)力;4分:尾部癱瘓+后肢部分癱瘓;5分:后肢完全癱瘓;6分:四肢癱瘓;7分:瀕死狀態(tài)或死亡。

1.4 HE染色 于各時(shí)間點(diǎn)取脊髓中腰膨大部分，放入4%多聚甲醛固定，制成石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，將切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，觀察組織中血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，并記數(shù)血管周圍袖套數(shù)目，3張切片上血管袖套數(shù)目取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)液修復(fù)后行caspase-3、IFN-γ免疫組織化學(xué)染色。結(jié)合HE染色結(jié)果，將免疫組織化學(xué)染色完畢的切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，按順序計(jì)數(shù)每張切片脊髓內(nèi)5個(gè)高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，細(xì)胞的表達(dá)以該片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/5表示，取三張切片的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 建立EAE大鼠動(dòng)物模型，選7d、14d、21d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物的平均神經(jīng)功能評(píng)分情況進(jìn)行比較。14d時(shí)，TWP1組、TWP2組與EAE組比較分值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，TWP2組與TWP1組比較分值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);21d時(shí)，TWP1組、TWP2組與 EAE 組比較之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 HE染色病理學(xué)改變 CON組大鼠脊髓HE染色均勻，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);其它各組均可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)血管“袖套”樣改變。第21天炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管“袖套”明顯減少。與14d組比較，21d組和7d組脊髓血管周圍炎癥細(xì)胞數(shù)均有不同程度減輕(P＜0.05)。與同期EAE組比較，TWP1組、TWP2組大鼠脊髓血管周圍炎癥細(xì)胞數(shù)均有不同程度減輕，以第14天、21天炎性病灶數(shù)減少明顯(P＜0.05)。TWP2組較同期的TWP1組炎性血管袖套數(shù)減少比較(P＜0.05)(見(jiàn)表2)。

2.3 大鼠脊髓caspase-3表達(dá)差異比較 正常組大鼠脊髓未見(jiàn)caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，EAE組與TWP1組、TWP2組內(nèi)可見(jiàn)明顯caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞漿著色，呈黃褐或黃色，不均勻散在分布，多見(jiàn)于灰白質(zhì)交界及“血管袖套”處。第14天組較第7天組和第21天組caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)。與同期EAE組比較，TWP1組和TWP2組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少 (P＜0.05)。14d TWP2組較TWP1組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少(P＜0.05)(見(jiàn)表3)。

2.4 大鼠脊髓處IFN-γ表達(dá)差異比較 正常組未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)。EAE模型組、TWP1組、TWP2組脊髓內(nèi)可見(jiàn)較高陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞染色呈棕黃色，胞核為主。與同期EAE組比較，TWP1組、TWP2組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有顯著性(P＜0.05)。第14天、21天TWP1組與TWP2組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表4)。

表1 各時(shí)期大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(±s)

表1 各時(shí)期大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(±s)

與EAE組比較*P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與TWP1組比較△P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較▲P＜0.05

組別7d 14d 21d EAE組TWP1組TWP2組1.25 ±0.52▲0.73 ±0.36 0.64 ±0.45 4.58 ±0.46 3.25 ±1.54*2.32 ±1.12＊△1.75 ±0.62▲0.87 ±0.43*0.63 ±0.52*

表2 不同時(shí)期各組大鼠脊髓炎性血管袖套數(shù)(±s)

表2 不同時(shí)期各組大鼠脊髓炎性血管袖套數(shù)(±s)

與EAE組比較*P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與 TWP1組比較，△P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較▲P＜0.05

組別7d 14d 21d EAE組TWP1組TWP2組1.83 ±0.42▲0.76 ±0.25 0.34 ±0.18△3.05 ±0.51 2.65 ±0.63*0.57 ±0.39＊△1.72 ±0.34▲0.86 ±0.57*0.21 ±0.26＊△

表3 各組大鼠脊髓caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)

表3 各組大鼠脊髓caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)

與EAE組比較*P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與TWP1組比較△P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較▲P＜0.05

組別 例數(shù)24h 72h EAE組TWP1組TWP2組27.18 ±4.23▲16.53 ±1.85*10.13 ±1.46*43.53 ±1.62 23.65 ±3.63*14.28 ±1.67＊△30.82 ±3.36▲19.25 ±1.54*11.20 ±2.46*

表4 各組大鼠脊髓IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)

表4 各組大鼠脊髓IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)

與EAE組比較*P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與 TWP1組比較，△P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較▲P＜0.05

組別 例數(shù)24h 72h EAE組TWP1組TWP2組20.11 ±3.59▲12.07 ±1.96*9.53 ±2.75*32.20 ±2.62 21.65 ±4.49*13.82 ±3.25＊△25.08 ±2.43▲15.62 ±1.78*8.22 ±1.64＊△

3 討論

多發(fā)性硬化(MS)是一種常見(jiàn)的由T細(xì)胞介導(dǎo)為主的自身免疫性疾病。其病理特征為中樞白質(zhì)的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和局部的脫髓鞘病變。IFN-γ是一種重要的免疫相關(guān)細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)Th1型反應(yīng)，起著免疫調(diào)節(jié)的作用［5］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EAE模型組、TWP1組、TWP2組脊髓白質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)較高陽(yáng)性表達(dá)，伴炎癥細(xì)胞圍繞在血管周圍成“袖套狀”改變。第14天EAE組大鼠發(fā)病率較高、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)最明顯，疾病處于高峰期。在此期IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)亦達(dá)到高峰，陽(yáng)性細(xì)胞高表達(dá)部位與EAE模型炎癥病灶部位一致。隨著病情緩解，IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)下降。提示IFN-γ參與了EAE的發(fā)病過(guò)程，并與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，這與Furuzawa［6］等報(bào)道的結(jié)論一致。在EAE/MS中CNS炎性反應(yīng)是脫髓鞘過(guò)程的第一步，研究表明［7］，EAE的早期軸索損傷與炎性脫髓鞘有關(guān)。MS炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生了大量的炎癥介質(zhì)，包括IFN-γ、TNF-α以及一氧化氮(NO)等，它們直接或間接作用于髓鞘，引起髓鞘脫失和軸索損傷［8］。營(yíng)養(yǎng)因子的缺乏、Ca2+超載等因素，誘發(fā)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，啟動(dòng)了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［9］。我們分析IFN-γ參與疾病的可能機(jī)制是:(1)IFN-γ等炎性因子激活單核細(xì)胞，誘導(dǎo)抗原在APC的表達(dá)。(2)誘導(dǎo)粘附分子在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，促進(jìn)抗原特異性CD4+T細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，血腦屏障破壞導(dǎo)致炎癥細(xì)胞及有害因子侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起脫髓鞘作用［10］。(3)IFN-γ是iNOS的主要誘導(dǎo)物，能誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞和外周巨噬細(xì)胞表達(dá) iNOS，參與 MS急性期的發(fā)病過(guò)程［11，12］。以上研究表明，EAE 大鼠脊髓中存在 IFN-γ陽(yáng)性的表達(dá)，且IFN-γ參與了EAE和MS的發(fā)病過(guò)程，陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量與疾病的活動(dòng)性有關(guān)。

Caspase正常情況下是以無(wú)活性的酶原形式存在的，在一定基因的調(diào)節(jié)下借助于細(xì)胞膜上的某些受體蛋白質(zhì)使凋亡的信號(hào)傳遞至caspase并使其呈“瀑布式”層層激活，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變使細(xì)胞最終發(fā)生凋亡。caspase在細(xì)胞凋亡過(guò)程中處于關(guān)鍵地位，是凋亡的重要標(biāo)志［13］。其中caspase-3是凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。本實(shí)驗(yàn)觀察到在 EAE發(fā)病高峰期caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)水平增高，并且與大鼠臨床癥狀、神經(jīng)功能評(píng)分變化趨勢(shì)相同。陽(yáng)性細(xì)胞高表達(dá)部位與EAE模型炎癥病灶分布基本一致，脊髓白質(zhì)周圍明顯，這提示在 Wistar大鼠 EAE模型中，caspase-3蛋白表達(dá)水平的變化與EAE病情程度密切相關(guān)。Cid等［3］也發(fā)現(xiàn)，在源于MS患者的腦脊液中培養(yǎng)的神經(jīng)元表達(dá)caspase-3活性和TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目，明顯高于對(duì)照組。EAE中不僅有淋巴細(xì)胞凋亡還有神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對(duì)疾病的進(jìn)展起著重要的作用。最近，EAE神經(jīng)元的凋亡越來(lái)越引起人們的關(guān)注。通過(guò)對(duì)MS患者M(jìn)RI和尸檢的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元與軸索的損害與其慢性神經(jīng)功能障礙密切相關(guān)。多發(fā)性硬化患者的腦脊液可以誘發(fā)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元的凋亡［3］。在MOG誘導(dǎo)的視神經(jīng)炎中也發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)元的凋亡［14］。Vercellinno M等通過(guò)對(duì)MS患者大腦皮層的病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)病灶區(qū)域神經(jīng)元的密度明顯減低，灰質(zhì)脫髓鞘和神經(jīng)元的丟失與殘疾和認(rèn)知障礙相關(guān)［15］。caspase誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡加劇了脫髓鞘和神經(jīng)功能的損害［16］。因此，caspase介導(dǎo)的凋亡與EAE的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。我們可以運(yùn)用caspase抑制劑來(lái)減輕髓鞘損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而治療MS［3］。

雷公藤多甙(TWP)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤根提取的活性成分，已在臨床上廣泛運(yùn)用于治療免疫性疾病，取得了良好的效果。鄭和忠等［17］的實(shí)驗(yàn)表明雷公藤多甙能明顯減輕EAE大鼠發(fā)病病情和延緩發(fā)病時(shí)間。但雷公藤多甙對(duì)EAE大鼠的保護(hù)作用機(jī)制如何，除抗炎抗免疫外是否還與其抑制EAE大鼠的神經(jīng)元凋亡有關(guān)，相關(guān)報(bào)道并不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)給予TWP干預(yù)后與EAE組比較發(fā)現(xiàn):TWP1組及TWP2組大鼠發(fā)病率降低，臨床癥狀減輕，病檢可見(jiàn)CNS內(nèi)炎性病灶明顯減少，脊髓中的caspase-3、IFN-γ表達(dá)明顯減低。這提示TWP對(duì)EAE大鼠有保護(hù)作用，且這種作用可能與其降低caspase-3、IFN-γ的水平有關(guān)。TWP1組與TWP2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，即在TWP治療劑量范圍內(nèi)，劑量越大，治療效果越明顯。結(jié)合以上情況，我們推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中caspase-3、IFN-γ表達(dá)水平變化的機(jī)制可能是:(1)雷公藤多甙可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。大量研究已證實(shí)雷公藤提取物能夠抑制多種免疫細(xì)胞中 NF-κB的活化［18］，減輕炎性細(xì)胞過(guò)度活化所致免疫損傷。(2)TWP能夠抑制一氧化氮(NO)及其產(chǎn)物，減輕炎性脫髓鞘所致軸索損害，發(fā)揮抗氧化作用［19］。(3)TWP能夠抑制caspase誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡，減輕脫髓鞘加劇所致神經(jīng)功能損害，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)早期應(yīng)用雷公藤多甙抑制 IFN-γ、caspase-3的表達(dá)，能明顯減輕炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而減輕神經(jīng)功能障礙的發(fā)生，為MS的治療提供了理論依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)僅從細(xì)胞水平觀察雷公藤多甙治療對(duì)EAE大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用，關(guān)于雷公藤多甙預(yù)處理對(duì)前炎癥因子、血腦屏障的影響及caspase通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)EAE大鼠神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制等還有待于進(jìn)一步研究，這將能更好地解釋雷公藤多甙對(duì)EAE保護(hù)作用的機(jī)制。

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