正交設(shè)計優(yōu)化金櫻子多糖的酶提取工藝

文全泰潘廷啟顏祖弟肖林彬張照平黃鎖義

（1右江民族醫(yī)學院臨床學院，廣西 百色 533000；2右江民族醫(yī)學院基礎(chǔ)學院；3右江民族醫(yī)學院藥學系）

正交設(shè)計優(yōu)化金櫻子多糖的酶提取工藝

文全泰1潘廷啟1顏祖弟2肖林彬1張照平2黃鎖義3

（1右江民族醫(yī)學院臨床學院，廣西 百色 533000；2右江民族醫(yī)學院基礎(chǔ)學院；3右江民族醫(yī)學院藥學系）

目的：確定金櫻子多糖的最佳酶提取工藝。方法：利用纖維素酶從金櫻子中提取多糖，采用正交試驗設(shè)計進行條件優(yōu)選，通過分光光度法對提取物進行多糖含量的測定。結(jié)果：檢測波長為490 nm，葡萄糖含量在0.010～0.100 mg/m L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 2），最佳酶提取工藝為pH=6，酶用量為6.0 m L，反應(yīng)溫度為60℃，酶解時間為2.0 h。在此條件下，金櫻子多糖的平均提取率為24.48%，RSD=1.47%。結(jié)論：優(yōu)選出的酶提取工藝合理、經(jīng)濟、可行。

金櫻子；多糖；纖維素酶；正交設(shè)計

金櫻子為薔薇科植物金櫻子（Rosa laevigata M ichx.）的干燥成熟果實?！侗静菥V目》記載金櫻子“性酸、澀、平，無毒；主治脾瀉下痢，止小便利，澀精氣；久服，令人耐寒輕身，補血益精，有奇效?！盵1]研究表明，金櫻子果實中富含的金櫻子多糖、黃酮等物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、提高機體免疫力等作用[2-4]，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域，市場前景廣闊，因此有效提取金櫻子多糖具有重要意義。

多糖是由單糖或衍生物聚合而成的大分子活性化合物，是一切生命有機體必不可少的成分，同維持生物機能密切相關(guān)[5]。20世紀60年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復雜多樣的生物活性和功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、延緩衰老、降血脂、抗血栓作用等[6]，因而越來越引起人們的關(guān)注。測定可溶性糖的含量可采用蒽酮比色法[7]、二硝基水楊酸法[8]、苯酚 -硫酸法[9]等。苯酚 -硫酸法操作簡便，重現(xiàn)性好，不要求特殊條件，幾乎可用于任何糖類及其衍生物的測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），電子分析天平 FA1104（上海天平儀器廠），植物粉碎機 FZ102（上海銳豐儀器儀表有限公司），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），電熱式恒溫水浴鍋HHS-21-4（江蘇金壇宏凱儀器廠），80-2離心沉淀器 （江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），722（N）可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

金櫻子（購自百色市右江區(qū)，由右江民族醫(yī)學院民族醫(yī)學教研室覃道光副教授鑒定）；纖維素酶(活力40 000 U/g)；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、活性炭、三氯甲烷、正丁醇、95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 纖維素酶懸浮液的制備

精密稱取纖維素酶2.500 g，用蒸餾水定容至1 000 m L（100 U/m L）放入冰箱待用，用前搖勻。

2.2 金櫻子多糖待測液的制備

將干燥的金櫻子在植物粉碎機上粉碎，制成金櫻子干粉。根據(jù)實驗按需稱取1.000 g金櫻子干粉若干份，加緩沖溶液及不同體積的酶懸浮液，緩沖液及酶懸浮液的總體積為20.0 m L，分別在不同pH值、酶用量、酶解溫度和提取時間等單因素條件下進行提取實驗。將提取液過濾后定容，取上液適量稀釋一定的倍數(shù)，待測。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以多糖的含量為實驗指標，進行L9（34）正交試驗。

2.3 金櫻子多糖的純化

準確稱取金櫻子干粉5.000 g，按最優(yōu)工藝提取，得多糖粗提液。粗提液減壓濃縮至10～20m L后離心，上清液加入5倍的無水乙醇醇沉，置冰箱中4℃過夜，收集沉淀，沉淀再依次用 95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，干燥得金櫻子粗多糖，沉淀物于熱蒸餾水復溶，使用Sevag法[10]多次脫蛋白，再用活性炭（粉末）回流 1 h，脫色，過濾，離心，得上清液。上清液濃縮，用無水乙醇調(diào)節(jié)濾液的醇濃度為80%，置冰箱中4℃沉淀過夜，抽濾收集沉淀，沉淀再用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌 3次，干燥得精制多糖。

2.4 金櫻子多糖提取率的檢測

本實驗對多糖的測定采用苯酚-硫酸法。取待測液0.5m L置于10.0m L的試管中，加入5%的苯酚溶液1.0 m L，混勻，迅速加入5.0 m L的濃硫酸，搖勻，40℃水浴中反應(yīng)30 m in，然后置于冷水中冷卻10 min，以葡萄糖為標樣，于波長490 nm處測定吸光度值。由一元線性回歸方程推算出金櫻子多糖的質(zhì)量。

2.5 換算因子測定

稱取金櫻子精制多糖約50 mg，精密稱定，置100 m L容量瓶中，加少量蒸餾水溶解并稀釋至刻度。精密吸取5.0 m L，定容至50.0 m L，按1.2.4中方法測定吸光度，按下式計算：

換算因子f=W/CD，

W 為多糖質(zhì)量（mg），C為多糖中葡萄糖的濃度（mg/m L），D為多糖的稀釋因素。測得f=0.775 2。

2.6 多糖含量測定

精密吸取待測液，按 2.4中方法測定吸光度值，按回歸方程求出待測液中葡萄糖含量，按下式計算樣品中多糖含量：

多糖含量（%）=CDf/W×100，

式中C為供試液葡萄糖濃度 (mg/m L)，D為供試液的稀釋因素，f為換算因子，W為供試品質(zhì)量（mg）。

2.7 標準曲線的繪制

稱取干燥（105℃）至恒重的葡萄糖約50 mg，精密稱定，加蒸餾水定容至100 m L，得標準葡萄糖溶液。取標準葡萄糖溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 m L，分別定容至 50 m L，得不同濃度的稀釋液。分別精密吸取上述稀釋液0.5 m L按1.2.4中方法顯色，測定吸光度值，以吸光度值（A）對質(zhì)量濃度C（mg／m L）進行回歸，得回歸方程：

表明對照品葡萄糖含量在0.010～0.100mg/m L范圍內(nèi)與對應(yīng)吸光度值有良好線性關(guān)系。

2.8 正交實驗

經(jīng)預實驗研究發(fā)現(xiàn)，對金櫻子多糖的提取有影響的主要因素有pH值、酶用量、酶解溫度、酶解時間。因此采用L9（34）正交試驗表進行正交試驗設(shè)計，因素水平見表1，并以金櫻子多糖的含量為評價指標，計算得到最佳工藝條件（見表2），方差分析見表3。

表1 正交因素水平

表2 L9（34）正交實驗及結(jié)果

表3 方差分析

根據(jù)試驗結(jié)果及方差分析可知，各因素對酶法提取金櫻子多糖的影響大小順序為A＞B＞C＞D，即pH值的影響最大，酶解時間的影響最小，從省時的角度考慮，確定金櫻子多糖酶輔助提取的最優(yōu)條件為 A2B3C2D2，即 pH值為 6，酶用量為6.0 m L，反應(yīng)溫度為60℃，酶解時間為2.0 h。

2.9 驗證試驗

取金櫻子 3份，每份 1.000 g，按優(yōu)選出的工藝進行提取，即pH值為6，酶用量為6.0 m L反應(yīng)溫度為60℃，酶解時間為2.0 h，結(jié)果見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果 （%）

按最佳提取條件進行提取，多糖提取率平均為24.48%，RSD為1.47%，結(jié)果與正交試驗中的8號試驗多糖提取率相近且高于8號試驗，因此得出的結(jié)果是可靠的，且工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

研究表明金櫻子中含有多糖、黃酮類物質(zhì)、三萜類及其衍生物等成分[11]，而大多數(shù)中藥材的細胞壁是由纖維素構(gòu)成，植物的有效成分往往包裹在細胞壁內(nèi)；而纖維素是由 β-D-葡萄糖以 1，4-β-葡萄糖苷鍵連接，纖維素酶酶解可以促進β-D-葡萄糖苷鍵的裂解，使植物細胞壁被破壞，有利于植物有效成分的浸出，還能促進殘留半乳甘露聚糖主鏈（1，4-β-葡萄糖苷鍵連接）的降解，降低提取液的黏度，而提高金櫻子多糖的提取率。

本實驗通過單因素試驗和正交試驗法，旨在優(yōu)化金櫻子多糖的酶解提取工藝，得出最佳酶解提取工藝為pH值為6，酶用量為6.0 m L，反應(yīng)溫度為60℃，酶解時間為2.0 h。并在此條件下，金櫻子多糖的最佳提取率為19.62%。而酶法提取金櫻子多糖操作簡單，節(jié)省成本，提取效率高，極大地縮短了提取周期，具有合理、經(jīng)濟、可行的優(yōu)點，因而應(yīng)用前景比較廣闊。

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Orthogonal Design for Optim ization of Enzyme Extracting Procedure of Polysaccharides from Rosa laevigata

Wen Quantai1，Pan Tingqi1，Yan Zudi2，Xiao Linbin1，Zhang Zhaoping2，Huang Suoyi3（1 Department of Clinical Medicine of Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China；2 Department of Basic Medicine of Youjiang Medical University for Nationalities；3 Department of Pharmacy of Youjiang Medical University for Nationalities）

Objective:To determ ine the optimized enzyme extracting procedure for the extraction of polysaccharides from rosa laevigata.M ethods:For the cellulase extraction of polysaccharides from rosa laevigata，orthogonal test design was used for the condition optim ization and spectrophotometric method was employed for the determ ination of polysaccharide content of extract.Results:The wavelength of the maximum absorption was at 490 nm.A good linear relationship of glucose concentration was w ithin the range of 0.010～0.100 mg/m L（r=0.999 2）.The optimum technological conditions for the extraction were as follows:pH was 6，amount of enzyme was 6 m L，the reaction temperaturewas at60℃and enzymatic hydrolysis timewas 2.0 h.Under these conditions，themean extraction ratewas 24.48%，（RSD=1.47%）.Conclusion:The optim ized enzyme extracting procedurewas reasonable，economic and feasible.

Rosa laevigata；Polysaccharide；Cellulase；Orthogonal Design

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.11.008

右江民族醫(yī)學院民族醫(yī)藥協(xié)會資助項目（20120516）

2012-03-06）

文全泰，男，本科在讀。研究方向：中藥有效成分提取。E-mail：wenquantai521@163.com

黃鎖義，男，教授，碩士生導師。研究方向：天然產(chǎn)物化學、藥物化學、食品衛(wèi)生。通訊作者E-mail：huangsuoyi@163.com

更正：本刊2012年第7期（總第103期）第27頁表1中C省三級醫(yī)院總數(shù)“37”更正為“35”，C省三級醫(yī)院抽樣數(shù)量“37”更正為“35”。