銀杏葉總黃酮對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

王遠(yuǎn)1 王海桃2

（1青島市第九人民醫(yī)院，山東 青島 266002；2青島市腫瘤醫(yī)院，266042）

腦 梗 死 （cerebral infarction，CI）[1]又 稱 缺 血 性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS），是指局部腦組織因血液循環(huán)障礙，缺血、缺氧而發(fā)生的軟化壞死。CI主要是由于供應(yīng)腦部血液的動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣硬化和血栓形成，使管腔狹窄甚至閉塞，導(dǎo)致局灶性急性腦供血不足而發(fā)病。CI具有發(fā)病率高、致殘率高、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，居腦血管病死亡原因之首。再灌注損傷可以使復(fù)流腦組織神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡加重，水腫明顯，梗死面積擴(kuò)大，并繼發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及植物神經(jīng)功能障礙。

銀杏葉味甘、苦、澀，性平，有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛功效。銀杏葉總黃酮是一種天然中草藥提取物，其中含有黃酮類、萜內(nèi)酯類、少量的多酚類、生物堿、長(zhǎng)鏈醇、酮類及微量元素等主要化學(xué)成分，其中銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯類物質(zhì)有拮抗血小板活化因子、抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管等作用[2]。本研究就銀杏葉總黃酮對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，為銀杏葉總黃酮在治療CI的醫(yī)藥領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

S-54紫外可見光分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；HH-SY11-Ni電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司）；GL-203Ⅱ離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 材料和試劑

昆明種小鼠（泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌性，15～ 25 g；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成科技有限公司）；舒血寧注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字Z11021351，北京雙鶴高科天然藥物有限責(zé)任公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 動(dòng)物分組與給藥

小鼠隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、模型組、銀杏葉總黃酮高劑量組（20 mg/kg）、銀杏葉總黃酮中劑量組（5 mg/kg）、銀杏葉總黃酮低劑量組（1 mg/kg），每組8只。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，銀杏葉總黃酮注射液腹腔注射連續(xù)給藥7 d。模型組和對(duì)照組在相同時(shí)間注射等量生理鹽水。末次給藥2 h后進(jìn)行腦缺血再灌注手術(shù)。術(shù)后繼續(xù)給藥，48 h后取血測(cè)定SOD、MDA，取腦組織切片做蘇木素-伊紅（HE）染色。

2.1.2 動(dòng)物模型的制備[3]

動(dòng)物于術(shù)前12 h禁食，稱重，按0.1 mL/10 g腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉麻醉。用醫(yī)用膠帶仰臥位固定小鼠，行頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及伴行的迷走神經(jīng)，從分離好的頸總動(dòng)脈下方穿過一條絲線，將絲線提起，掛于鐵架臺(tái)上阻斷血流，15 min后松線恢復(fù)腦血液循環(huán)，10 min后實(shí)行再灌注，重復(fù)3次，縫合頸部皮膚。術(shù)后將小鼠置于37℃恒溫環(huán)境促其蘇醒。術(shù)后及時(shí)供應(yīng)水分及飼料。對(duì)照組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及伴行的迷走神經(jīng)。

2.1.3 形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)定

小鼠手術(shù)后48 h斷頭取腦，將腦組織固定在40%中性甲醛48 h后，流動(dòng)水沖洗24 h，梯度酒精脫水，按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋，切片依次入二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水，雙蒸水洗2次，蘇木精染色 8 min，1%鹽酸酒精分色，堿性水藍(lán)化，伊紅10 min復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并照相。

2.1.4 血清指標(biāo)測(cè)定

小鼠術(shù)后48 h摘眼球取血于1.5 mL離心管中，4℃靜置 24 h，3 000 r/min 離心 10 min，取上清按照各試劑盒說明書進(jìn)行血清中SOD、MDA含量測(cè)定。

2.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 銀杏葉總黃酮對(duì)小鼠腦神經(jīng)形態(tài)的影響

小鼠腦皮層區(qū)及海馬區(qū)HE染色結(jié)果如圖1、2所示：對(duì)照組腦神經(jīng)細(xì)胞呈橢圓形，排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，核染色質(zhì)稀疏，核仁清楚；模型組腦神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯下降，變性細(xì)胞數(shù)明顯增多，可見許多神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯形狀上的改變，細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮，染色質(zhì)凝集；與模型組相比，中劑量組明顯減輕了神經(jīng)細(xì)胞的變性。

2.2.2 銀杏葉總黃酮對(duì)小鼠血清SOD、MDA的影響

圖1 小鼠腦組織皮層區(qū)HE染色結(jié)果（×400）

圖2 小鼠腦組織海馬區(qū)HE染色結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中的SOD活性下降，MDA含量增加；與模型組相比，銀杏葉總黃酮?jiǎng)t使小鼠血清中的SOD活性增強(qiáng)，并使MDA含量下降（見表1）。

表1 銀杏葉總黃酮對(duì)小鼠血清中SOD和MDA影響（n=8，±s）

表1 銀杏葉總黃酮對(duì)小鼠血清中SOD和MDA影響（n=8，±s）

注：*用藥組與模型組比較，P＜0.05；Δ模型組與對(duì)照組比較，P＜0.05；**用藥組與模型組比較，P＜0.01；Δ Δ模型組與對(duì)照組比較，P＜0.01

組別 劑量（mg/kg）SOD（U/mL）MDA（U/10mL）對(duì)照組 - 193.00±9.10 38.6±28.5模型組 - 166.98±20.87Δ 120.0±17.3ΔΔ低劑量組 1 167.66±26.33 96.2±14.8**中劑量組 5 196.23±19.68* 83.6±16.4**高劑量組 20 198.71±20.20* 68.4±15.2**

3 討論

銀杏是地球上存活最久的植物之一，銀杏葉始載于《本草品匯精要》，作為祖國(guó)的傳統(tǒng)中藥已沿用數(shù)千年。銀杏葉總黃酮具有廣泛的生理活性，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)腦能量代謝、保護(hù)神經(jīng)元、增強(qiáng)記憶等功能。由于銀杏葉的有效成分已基本確認(rèn)，近年來出現(xiàn)了一些關(guān)于銀杏葉的臨床藥理學(xué)及應(yīng)用研究。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行HE染色，研究發(fā)現(xiàn)腦缺血灌注的小鼠較正常小鼠相比，腦神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯下降，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞明顯，而經(jīng)銀杏葉總黃酮預(yù)處理后，可以明顯減輕腦神經(jīng)細(xì)胞的受損程度，改善小鼠的CI情況，表明銀杏葉總黃酮對(duì)CI具有一定的保護(hù)作用。

缺血性腦損傷是多種病理機(jī)制交互作用的結(jié)果[4]，在諸多損傷因素中，神經(jīng)細(xì)胞能量衰竭被認(rèn)為是首先發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，腦組織缺血后能量代謝的異常，使線粒體內(nèi)電子傳遞失調(diào)，致使氧分子接受單個(gè)電子生成氧自由基，同時(shí)黃嘌呤氧化酶（XO）系統(tǒng)被激活，XO在將三磷酸腺苷（ATP）的降解產(chǎn)物次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤，并產(chǎn)生大量氧自由基，另外SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等自由基清除系統(tǒng)被大量消耗也造成缺血后腦組織自由基的堆積。自由基損傷的主要病理機(jī)制是腦缺血再灌注后，由于腦組織中富含脂質(zhì)，極易受到氧自由基的攻擊，膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化，破壞了膜脂質(zhì)的代謝和結(jié)構(gòu)，并生成了一系列脂質(zhì)自由基及其降解產(chǎn)物MDA[5]。自由基也可直接氧化酶蛋白氨基酸殘基，引起酶蛋白構(gòu)象改變，使酶失活。

正常生物體內(nèi)自由基生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡[6]，腦缺血時(shí)，氧供應(yīng)不足，大量的自由基生成，使腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用加強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞及細(xì)胞屏障損害，神經(jīng)元壞死或凋亡，引起和加重缺血腦組織水腫。再灌注恢復(fù)組織氧供應(yīng)，也提供了大量電子受體，使氧自由基在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)性增多。SOD為抗氧化酶，是體內(nèi)主要的自由基清除劑，能催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，清除體內(nèi)超氧自由基，對(duì)維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整，延緩細(xì)胞衰老發(fā)揮重要作用[7]。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，其活性可以間接反映機(jī)體清除自由基的能力，因此，可將SOD活性大小作為機(jī)體抗氧化能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注可使小鼠血清中SOD活性降低，而給予銀杏葉總黃酮預(yù)處理后，可減輕這種損傷，提高血清中SOD活性[8]。

機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物[9]，如醛基（如MDA）、酮基、羥基、氫過氧基等。脂質(zhì)過氧化作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化為活性化學(xué)劑，即非自由基性的脂類分解產(chǎn)物，而且可通過鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)，放大活性氧的作用。因而測(cè)定MDA的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度[10]。本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注可使小鼠血清中MDA含量升高，給予銀杏葉總黃酮預(yù)處理后，可減輕腦缺血再灌注引起的損傷，降低MDA含量。

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