22株耐亞胺培南腸桿菌科細(xì)菌KPC酶及整合子分布

陶月 寧明哲 張葵 張之烽

22株耐亞胺培南腸桿菌科細(xì)菌KPC酶及整合子分布

陶月 寧明哲 張葵 張之烽

目的了解耐亞胺培南的腸桿菌科細(xì)菌KPC酶(klebsiella pneumoniae carbapenemase)及整合子分布情況。方法收集南京市鼓樓醫(yī)院22株耐亞胺培南的腸桿菌科細(xì)菌，進(jìn)行改良Hodge試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增檢測(cè)細(xì)菌KPC酶與整合子基因并行序列分析。結(jié)果22株腸桿菌科細(xì)菌中，改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性15株(68．2%)，KPC酶擴(kuò)增陽(yáng)性15株(68．2%)，整合子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性6株(27．3%)。結(jié)論KPC酶的流行需引起實(shí)驗(yàn)室及臨床的關(guān)注。

腸桿菌科細(xì)菌KPC酶整合子

碳青霉烯類藥物是臨床治療革蘭陰性桿菌感染的最有效藥物之一，它可用于治療產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶等多重耐藥菌引起的感染，包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等。但隨著其廣泛使用，耐藥菌株也隨之出現(xiàn)。先是在鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等非發(fā)酵菌中出現(xiàn)對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的細(xì)菌，而產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌于2001年在美國(guó)北卡羅來(lái)納州首次被發(fā)現(xiàn)，之后數(shù)年間，產(chǎn)KPC酶菌株已在美國(guó)各州蔓延，且在多種腸桿菌科細(xì)菌中均有報(bào)道［1］。2010年4月，筆者醫(yī)院首次檢出出現(xiàn)耐亞胺培南的肺炎克雷伯菌，至2011年6月共出現(xiàn)22株耐亞胺培南的腸桿菌科細(xì)菌。現(xiàn)對(duì)該22株菌進(jìn)行改良Hodge實(shí)驗(yàn)、KPC酶及整合子基因檢測(cè)。

材料與方法

1．菌株來(lái)源:收集南京市鼓樓醫(yī)院2010年4月～2011年4月臨床分離的耐亞胺培南的腸桿菌科細(xì)菌共22株。

2．鑒定方法:全部菌株均使用法國(guó)生物－梅里埃公司ATB鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923，銅綠假單胞菌ATCC27853。

3．藥敏試驗(yàn):細(xì)菌采用紙片擴(kuò)散(K－B)法，結(jié)果按CLSI2010年版標(biāo)準(zhǔn)判定。藥敏紙片均購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司。質(zhì)控菌的試驗(yàn)結(jié)果均在CLSI規(guī)定范圍內(nèi)。

4．試劑:PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，Taq酶購(gòu)自日本Takara公司，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio－Rad公司)，普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

5．改良Hodge試驗(yàn):將0．5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏拇竽c桿菌ATCC25922菌液均勻涂布在MH平板上，中間貼美羅培南(10μg)紙片，將實(shí)驗(yàn)菌株以美羅培南紙片為起點(diǎn)，用無(wú)菌接種環(huán)自紙片外緣向平板邊緣以離心方向劃線，以肺炎克雷伯菌ATCC1705為陽(yáng)性對(duì)照，肺炎克雷伯菌ATCC1706為陰性對(duì)照，35℃培養(yǎng)16～18h后觀察結(jié)果，美羅培南抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)待檢菌矢狀生長(zhǎng)者為陽(yáng)性。陽(yáng)性表明產(chǎn)KPC酶，見(jiàn)圖1。

圖1 改良Hodge實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6．耐藥基因檢測(cè):(1)模板和引物:加熱煮沸法制備DNA模板，參考文獻(xiàn)合成KPC酶基因引物，引物F:5'－GCTACACCTAGCTCCACCTTC－3';引物R:5'－ACAGTGGTTGGTAATCCATGC－3'。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)可同時(shí)檢測(cè)Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類整合子的整合酶基因(intI1、intI2和intI3)的簡(jiǎn)并引物，引物1:5'－TGCGGGTYAARGATBTKGATTT－3';引物2:5'－CARCACATGCGTRTA RAT－3'［2～4］。(2)耐藥基因PCR:KPC酶50μl反應(yīng)體系含10×PCR Buffer 5μl，Mg2+4μl，dNTP (2.5mmol/L)4μl，TaqDNA聚合酶0．5μl，引物各1μl (10μmol/L)，DNA模板2μl，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃45s、55℃40s、72℃70s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。目的條帶920bp。整合酶25μl反應(yīng)體系含10×PCR Buffer 2．5μl，Mg2+2．5μl，dNTP(2．5mmol/L)2μl，TaqDNA聚合酶0．5μl，引物各1μl(10μmol/L)，DNA模板2μl，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min;94℃30s、50℃40s、72℃40s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。目的條帶491bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳120V 20min，凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察記錄結(jié)果。陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)純化后用HITACHI 3130測(cè)序儀測(cè)序，所得DNA序列用BLAST程序與GenBank中的NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線比對(duì)。

結(jié)果

1．菌株構(gòu)成:收集的22株待檢菌中，有肺炎克雷伯菌14株(63．6%)，大腸桿菌5株(22．8%)，產(chǎn)酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌各1株(各占4.5%)。

2．實(shí)驗(yàn)結(jié)果:22株待檢菌中，改良Hodge實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌有15例(68．2%)，KPC基因檢測(cè)陽(yáng)性有15例(68．2%)，整合子檢測(cè)陽(yáng)性有6例(27．3%)。KPC擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，均為KPC－2型(圖2)。15株肺炎克雷伯菌中，改良Hodge實(shí)驗(yàn)與KPC基因檢測(cè)陽(yáng)性菌有12例(80．0%)，整合子檢測(cè)陽(yáng)性有4例(26．7%)。其他7株腸桿菌科細(xì)菌中，改良Hodge實(shí)驗(yàn)與KPC基因檢測(cè)陽(yáng)性有3例(20．0%)，整合子檢測(cè)陽(yáng)性有2例(28．6%，圖3～圖4及表1～表3)。

表1 22株待檢菌檢測(cè)結(jié)果

表2 15株肺炎克雷伯菌改良Hodge實(shí)驗(yàn)、KPC酶、整合子檢測(cè)結(jié)果分類

表3 其他7株腸桿菌科細(xì)菌改良Hodge實(shí)驗(yàn)、KPC酶、整合子檢測(cè)結(jié)果分類

經(jīng)卡方檢驗(yàn)，22株待檢菌中，KPC與整合子基因檢測(cè)有明顯差異(χ2=7．37，P＜0．01)，改良Hodge實(shí)驗(yàn)和KPC酶基因檢測(cè)符合率為100%。而在15株肺炎克雷伯菌中KPC陽(yáng)性12例(80．0%)，7株其他腸桿菌科細(xì)菌中KPC陽(yáng)性3株(42．9%)，KPC陽(yáng)性率在肺炎克雷伯菌與其他腸桿菌科細(xì)菌中沒(méi)有明顯差異(χ2=1．56，P＞0．05)。

討論

腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的機(jī)制是產(chǎn)生碳?xì)涿赶┟福訩PC酶為主。此酶可水解青霉素類、頭孢菌素類、單酰胺類和碳?xì)涿赶╊惪股?。這種活性可被克拉維酸和他唑巴坦所抑制，但對(duì)EDTA不敏感。目前已發(fā)現(xiàn)的KPC型酶已有11種，分別從KPC－1型至KPC－11型酶［3］。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，中國(guó)地區(qū)均以KPC－2型檢出率較高，國(guó)內(nèi)先后分離到產(chǎn)KPC－2型肺炎克雷伯菌，大腸桿菌，黏質(zhì)沙雷菌［4～6］。本研究中，共檢測(cè)到15株菌產(chǎn)KPC酶，經(jīng)測(cè)序亦均為KPC－2型。

2009年CLSI提出用改良Hodge實(shí)驗(yàn)作為檢測(cè)碳?xì)涿赶┟傅暮Y選實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中，改良Hodge實(shí)驗(yàn)與KPC－PCR檢測(cè)結(jié)果完全吻合，未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性。這次檢測(cè)的22株細(xì)菌均為對(duì)亞胺培南耐藥的腸桿菌科細(xì)菌，未出現(xiàn)中介，使得改良Hodge實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度提高［7］。整合子是抗生素耐藥基因的重要存儲(chǔ)庫(kù)，在細(xì)菌多重耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用［8］。本實(shí)驗(yàn)中，整合子檢出率較低，可見(jiàn)整合子在耐碳青霉烯過(guò)程中并非其主要作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)吞记嗝瓜☆惖哪c桿菌科細(xì)菌中，KPC酶檢測(cè)仍有7株為陰性，其中2株為整合子檢測(cè)陽(yáng)性，余下5株可能與其他耐藥機(jī)制相關(guān):①外膜蛋白丟失合并AmpC等酶高產(chǎn)［9］;②藥物作用靶位的改變;③產(chǎn)生其他碳青霉烯酶，如IMP等。KPC酶的出現(xiàn)給腸桿菌科細(xì)菌感染的治療帶來(lái)不小的困難。如何防止其流行，加強(qiáng)對(duì)其監(jiān)測(cè)，是臨床和實(shí)驗(yàn)室共同關(guān)注的目標(biāo)。

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(收稿:2011－11－26)

(修回:2011－12－16)

Distribution of KPC and Integrons in 22 Imipenem－resistant Enterobacteriaceae．

Tao Yue，Ning Mingzhe，Zhang Kui，Zhang Zhifeng．Department of Clinical Laboratory，Drum Tower Hospital of Nanjing，Jiangsu 210008，China

ObjectiveTo investigate the distribution of KPC and integrons in imipenem－resistant Enterobacteriaceae．Methods We modified Hodge test and PCR amplification for 22 imipenem－resistant Enterobacteriaceae from Nanjing Drum Tower Hospital，detected KPC and integron of bacterial and did sequence analysis．ResultsIn 22 Enterobacteriaceae，15 strains(68．2%)were positive in the modified Hodge，15 strains(68．2%)were positive in KPC amplification，6 strains(27．3%)were positive in PCR amplification of integron．ConclusionKPC Shold be paid attention as it may to cause the prevalence of laboratory and clinical attention．

Enterobacteriaceae;KPC;Integron

南京市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目(YKK09115)

210008南京市鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科

張葵，電子信箱:zkangkui@yahoo．com．cn