蛋白酶抑制劑leupeptin增強(qiáng)抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

王瑩 吳淑英 甄永蘇

蛋白酶抑制劑leupeptin增強(qiáng)抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

王瑩 吳淑英 甄永蘇

目的研究蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)leupeptin對(duì)化療藥物紫杉醇(taxol，TAX)、吉西他濱(gemcitabine，GEM)以及平陽(yáng)霉素(pingyangmycin，PYM)在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響。方法選取一定濃度梯度的酶抑制劑leupeptin單獨(dú)或聯(lián)合TAX、GEM和PYM與腫瘤細(xì)胞孵育，48h后采用MTT法測(cè)定腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的變化并與相應(yīng)濃度的TAX、GEM和PYM單藥組相比較。采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定MCF－7細(xì)胞周期分布。結(jié)果leupeptin在濃度高于50μmol/L時(shí)可增強(qiáng)化療藥物對(duì)肺癌PG細(xì)胞和乳腺癌MCF－7細(xì)胞增殖的抑制作用。leupeptin對(duì)TAX的增效作用尤為顯著。leupeptin與低濃度的GEM和TAX聯(lián)合應(yīng)用可改變MCF－7的細(xì)胞周期分布。結(jié)論leupeptin可增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，但其作用程度與腫瘤細(xì)胞株的種類(lèi)、化療藥物的種類(lèi)及l(fā)eupeptin的濃度均相關(guān)。

LeupeptinMCF－7細(xì)胞PG細(xì)胞增殖抑制

化療增敏劑是指在所用濃度或劑量下沒(méi)有抗腫瘤作用或抗腫瘤作用很小，但能影響已知有抗腫瘤作用藥物的細(xì)胞毒作用，從而可增強(qiáng)抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用或降低其對(duì)正常組織細(xì)胞毒性的一類(lèi)藥物。目前對(duì)腫瘤化療增敏劑的研究較多。主要側(cè)重于多藥耐藥蛋白、藥物代謝酶及DNA的修復(fù)等相關(guān)方面。另一些研究集中于改變腫瘤細(xì)胞的外周環(huán)境，以期待改良腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。目前的一些研究探討微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞之間相互關(guān)系，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)于抗腫瘤藥物的敏感性。此外還有一些學(xué)者研究基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑對(duì)血管生成的抑制，影響腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)等。這些低分子化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，作用于腫瘤細(xì)胞的多種靶點(diǎn)，對(duì)化療藥物的藥效均起到了一定的促進(jìn)作用。

leupeptin是一種廣泛的絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制物，能抑制其他細(xì)胞中的程序化細(xì)胞死亡，被認(rèn)為是參與凋亡進(jìn)程的蛋白酶抑制劑，呈底物競(jìng)爭(zhēng)抑制作用［1，2］。最初由X射線在小鼠C3H10T 1/2細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，作為絲氨酸和巰基蛋白酶(如胰蛋白酶、血纖維蛋白溶解酶、木瓜蛋白酶和組織蛋白酶B)的抑制劑。隨后被證實(shí)可減弱化學(xué)致癌劑對(duì)大鼠的作用［3］。其分子結(jié)構(gòu)為Acetyl－ Leu－Leu－Arginal，是一種低分子肽醛類(lèi)化合物。多種細(xì)胞外周(包括細(xì)胞表面和釋放于外周)的組織蛋白酶活性均可為leupeptin所抑制［4］。它作為一種工具藥物被廣泛的應(yīng)用于生化實(shí)驗(yàn)中。多種研究表明leupeptin作用于腫瘤細(xì)胞的多種信號(hào)通路和多個(gè)靶點(diǎn)，主要作用于細(xì)胞遷移方面，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的多種酶類(lèi)也有一定的影響。對(duì)于leupeptin的研究，涉及多種組織和細(xì)胞［5，6］。本實(shí)驗(yàn)擬研究leupeptin與化療藥物聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)選取3種不同機(jī)制的抗腫瘤藥物:抗代謝類(lèi)藥物吉西他濱(gemcitabine，GEM)、抗微管解聚類(lèi)藥物紫杉醇(taxol，TAX)和DNA干擾藥物平陽(yáng)霉素(pingyangmycin，PYM)，研究酶抑制劑leupeptin與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響。

材料與方法

1．材料:①細(xì)胞株:人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PG細(xì)胞株和人乳腺腺癌MCF－7細(xì)胞株由本室傳代保存;②leupeptin:美國(guó)Ameresco公司產(chǎn)品;③注射用鹽酸吉西他濱:江蘇森豪藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;④紫杉醇注射液:北京協(xié)和藥廠產(chǎn)品;⑤注射用鹽酸平陽(yáng)霉素:天津太河制藥有限公司產(chǎn)品。⑥MTT:購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)公司。⑦RPMI 1640培養(yǎng)基:Hyclone公司提供，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清:Gibco公司提供。

2．MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖作用:①細(xì)胞培養(yǎng):PG細(xì)胞和MCF－7細(xì)胞用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng);②采用四氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)不同濃度的leupeptin與GEM、TAX和PYM單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)PG與MCF－7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。將細(xì)胞懸液以5000個(gè)/孔接種與96孔板中，培養(yǎng)48h后分別加leupeptin，3h后加入GEM、TAX和PYM。同時(shí)設(shè)置空白組、對(duì)照組和聯(lián)合組。48h后以MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒作用，計(jì)算細(xì)胞存活率T/C(%)及兩藥相互作用指數(shù)(coefficient of drug interaction，CDI)。計(jì)算方法如下:細(xì)胞存活率T/C(%)=加藥組細(xì)胞的吸光值/對(duì)照組細(xì)胞的吸光值×100%;CDI=AB/(A×B)。AB為兩藥聯(lián)合作用組的T/C值，A、B是藥物單獨(dú)作用組的T/C比值。當(dāng)CDI＜1時(shí)兩藥有協(xié)同作用。

3．PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布:離心收集藥物處理過(guò)的細(xì)胞，用冰冷的PBS緩沖液沖洗后，離心倒掉上清保留少許液體，加－20℃預(yù)冷的乙醇至70%濃度，固定過(guò)夜，磷酸緩沖液洗3次后，經(jīng)RNase消化30min，碘化丙錠(propidium iodide，PI)37℃染色30min以上，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，COULTER EPICS XL流式細(xì)胞分析儀測(cè)定細(xì)胞周期分布。

結(jié)果

1．leupeptin與GEM聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響:用MTT法檢測(cè)不同濃度的leupeptin和GEM處理PG細(xì)胞和MCF－7細(xì)胞后，leupeptin與GEM的聯(lián)合組對(duì)PG細(xì)胞和MCF－7細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制作用較對(duì)照組(P＜0．05)略有增加。各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率見(jiàn)圖1中A1和A2。同等劑量下，GEM對(duì)PG細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于與MCF－7細(xì)胞。PG細(xì)胞和MCF－7細(xì)胞對(duì)leupeptin的敏感度不同。leupeptin可在一定水平增強(qiáng)GEM對(duì)MCF－7細(xì)胞的增殖抑制作用，但是對(duì)PG細(xì)胞的作用卻較弱。在MCF－7細(xì)胞組中50μmol/L以上的leupeptin對(duì)各濃度組的細(xì)胞增殖抑制均有加強(qiáng)作用，100μmol/L leupeptin與5μmol/L的GEM的聯(lián)合組與5μmol/L GEM單獨(dú)組，細(xì)胞存活率分別為94．05%±1．92%和76．92%± 2.64%，100μmol/L leupeptin單獨(dú)組為92．00%± 9.96%，兩藥的CDI值為0．892(CDI＜1)。而在PG細(xì)胞組中僅在高濃度的GEM組出現(xiàn)明顯的增殖抑制加強(qiáng)，100μmol/L leupeptin與20μmol/L的GEM的聯(lián)合組與20μmol/L GEM單獨(dú)組，細(xì)胞存活率分別為56．08%±4．84%和66．21%±1．55%，100μmol/L leupeptin單獨(dú)組為93．05%±3．32%，兩藥的CDI值為0．872(CDI＜1)。

2．leupeptin與TAX聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影

圖1 不同濃度leupeptin與GEM、TAX和PYM聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MCF－7和PG細(xì)胞增殖的影響

3．leupeptin與PYM聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響:用MTT法檢測(cè)不同濃度的leupeptin和PYM處理PG細(xì)胞和MCF－7細(xì)胞后，leupeptin與PYM的聯(lián)合組對(duì)PG細(xì)胞和MCF－7細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制作用較對(duì)照組(P＜0．05)顯著增加。其細(xì)胞增殖的抑制率見(jiàn)圖1中C1和C2。PYM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與GEM類(lèi)似，leupeptin對(duì)MCF－7細(xì)胞抑制的增效作用較PG細(xì)胞為強(qiáng)。在MCF－7細(xì)胞組實(shí)驗(yàn)中100μmol/L leupeptin與20μmol/L的PYM的聯(lián)合組與20μmol/L PYM單獨(dú)組，細(xì)胞存活率分別為68．06%±1．14%和56.85%±7.14%，100μmol/L leupeptin單獨(dú)組為92．00%±9．96%，兩藥的CDI值為0．926(CDI＜1)。在PG組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中100μmol/L leupeptin與1μmol/L的PYM的聯(lián)合組與1μmol/L PYM單獨(dú)組，細(xì)胞存活率分別為78．66%±1．39%和96．27%± 5.79%，100μmol/L leupeptin單獨(dú)組為93．05%± 3.32%，兩藥的CDI值為0．878(CDI＜1)。

4．藥物對(duì)細(xì)胞周期分布的影響:為進(jìn)一步研究?jī)伤幝?lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制的機(jī)制，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。藥物分別作用于MCF－7細(xì)胞，48h收集細(xì)胞，PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和表1所示。與對(duì)照組相比，單獨(dú)應(yīng)用100μmol/L leupeptin對(duì)細(xì)胞周期無(wú)影響。leupeptin的加入可影響GEM和TAX對(duì)MCF－7細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作用。100μmol/L leupeptin與2μmol/L GEM聯(lián)合組可以使G1期的細(xì)胞比例增加，100μmol/L leupeptin與0.5μmol/L TAX聯(lián)合組使S期細(xì)胞增加。

圖2 leupeptin與GEM和TAX對(duì)MCF－7細(xì)胞周期時(shí)相分布的影響

表1 GEM、TAX和leupeptin聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MCF－7細(xì)胞周期分布的影響

討論

leupeptin廣泛的應(yīng)用于抑制多種的絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶類(lèi)。它的作用特點(diǎn)是作用范圍廣，但是特異性不強(qiáng)，可作用于細(xì)胞生長(zhǎng)及腫瘤形成的多個(gè)階段。據(jù)報(bào)道leupeptin在體外可抑制胰腺癌細(xì)胞跨越基質(zhì)膠屏障發(fā)生遷移［7］。其原因在于抑制了可降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶類(lèi)，這些酶類(lèi)可參與腫瘤細(xì)胞的遷移。leupeptin可明顯降低黑色素瘤細(xì)胞的遷移，該結(jié)果提示半胱氨酸水解酶在腫瘤遷移過(guò)程中具有重要作用［8］。組織蛋白酶B涉及多種腫瘤的的侵襲和轉(zhuǎn)移，特別是細(xì)胞表面和分泌型的cathepsin B。而對(duì)cathepsin B和calpain相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，leupeptin可以抑制該類(lèi)cathepsin B［9］。通過(guò)比較了博來(lái)霉素人頭頸部癌細(xì)胞的敏感細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株后發(fā)現(xiàn)，leupeptin可提高耐藥細(xì)胞株對(duì)博來(lái)霉素的敏感性，并表明細(xì)胞內(nèi)的代謝酶參與了該細(xì)胞株的耐藥過(guò)程［10］。

本研究結(jié)果表明leupeptin在體外可部分的提高TAX、GEM和PYM對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，但其本身并無(wú)明顯的細(xì)胞毒活性，對(duì)細(xì)胞周期的分布也不會(huì)造成干擾。比較leupeptin在與上述3個(gè)化療藥物聯(lián)合作用時(shí)的CDI值，在一定的濃度聯(lián)合均有協(xié)同增殖抑制作用(CDI＜1)，100μmol/L leupeptin與20μmol/L TAX和200μmol/L leupeptin與5μmol/L TAX能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，其CDI＜0．70，具有顯著協(xié)同抗腫瘤作用。此外，TAX對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的影響還具有如下的幾個(gè)特點(diǎn):①具有藥物的選擇性:對(duì)細(xì)胞毒性較強(qiáng)的藥物如紫杉醇的作用效果較其他兩種藥物為顯著，對(duì)多個(gè)藥物劑量組均呈增強(qiáng)作用。而吉西他濱對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用相對(duì)較弱，僅在高濃度的吉西他濱與leupeptin聯(lián)合組出現(xiàn)了增強(qiáng)作用;②腫瘤細(xì)胞株對(duì)leupeptin的敏感性有差異。從本實(shí)驗(yàn)可以看出，MCF－7細(xì)胞對(duì)leupeptin的敏感度要高于PG細(xì)胞，在多種藥物的多個(gè)濃度水平均有提高作用;③leupeptin需要在濃度較高時(shí)起效，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)趨勢(shì)。上述的幾組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，leupeptin至少要在濃度高于50μmol/L時(shí)才會(huì)起到增效作用。結(jié)合以上3個(gè)特點(diǎn)，可以看出leupeptin的作為增效劑的活性有特殊性。

在本研究中，MCF－7細(xì)胞對(duì)leupeptin的敏感性要高于PG細(xì)胞，尤其是與紫杉醇聯(lián)合的藥物組。相關(guān)的研究也探討了各種化合物與化療藥物聯(lián)合作用于乳腺癌細(xì)胞株，期望能改善化療藥物對(duì)乳腺癌，特別是HER－2高表達(dá)及多藥耐藥的細(xì)胞株的作用。包括天然提取物姜黃素、大黃酸和磷酸二酯酶抑制西地那非等多種低分子成為研究對(duì)象。據(jù)報(bào)道，在HER－2高表達(dá)的BT－474細(xì)胞株移植模型中發(fā)現(xiàn)姜黃素與紫杉醇的聯(lián)合用藥組的療效與紫杉醇和herceptin的聯(lián)合用藥組相當(dāng)［11］。賴(lài)氨大黃酸能有效抑制SK－Br－3細(xì)胞增殖并且能夠通過(guò)HER－2信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還參與了NF－κB/p53/p21等誘導(dǎo)凋亡的多種信號(hào)通路，有望成為臨床腫瘤輔助化療藥物［12］。然而，對(duì)西地那非進(jìn)行的相關(guān)實(shí)驗(yàn)則沒(méi)有取得顯著的效果［13］。綜合上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，leupeptin在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞有明確的抑制作用。鑒于leupeptin廣泛的作用位點(diǎn)，特殊的結(jié)構(gòu)類(lèi)型，希望通過(guò)進(jìn)一步的研究，將leupeptin及其類(lèi)似物應(yīng)用于促進(jìn)化療藥物的活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及誘導(dǎo)細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等多種環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用。

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(收稿:2012－01－16)

(修回:2012－03－07)

Protease Inhibitor Leupeptin Enhances the Inhibitory Effect of Anticancer Drugs on the Proliferations of Cancer Cells．

Wang Ying，Wu Shuying，Zhen Yongsu．Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Science＆Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

ObjectiveTo observe the modulating effect of leupeptin，a protease inhibitor，on the anti－proliferation efficacy of anticancer drugs including taxol(TAX)，gemcitabine(GEM)，and pingyangmycin(PYM)in cancer cells．MethodsMammary carcinoma MCF－7 cells and pulmonary carcinoma PG cells were exposed to various concentrations of leupeptin alone or in combination with taxol (TAX)，gemcitabine(EM)，and pingyangmycin(PYM)，respectively．After 48 hours exposure，cell proliferation was determined by MTT assay．Flow cytometry was used to analyze cell cycle distribution．ResultsAt the concentration of 50μmol/L or higher，leupeptin enhanced the inhibitory effect of those three anticancer drugs on the proliferation of both cell line．More marked enhancement was found in the combination of leupeptin and TAX．MCF－7 cell cycle distributions were changed at the low dosage GEM or TAX combination with leupeptin．ConclusionLeupeptin could enhance the inhibition effect of anticancer drugs，in particular，taxol，on cancer cells．The efficacy may be varied in different cell lines and drugs．

Leupeptin;MCF－7 cell;PG cell;Proliferation inhibitor

100050中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所

甄永蘇，電子信箱:zhenys@cae．cn