基因?qū)胪緩脚c腦內(nèi)表達(dá)的關(guān)系研究

趙浩 李運(yùn)軍 陳立華 魏群 戴宜武 徐如祥 王任直

基因?qū)胪緩脚c腦內(nèi)表達(dá)的關(guān)系研究

趙浩 李運(yùn)軍 陳立華 魏群 戴宜武 徐如祥 王任直

目的比較不同途徑(股靜脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、側(cè)腦室及鞘內(nèi))導(dǎo)入轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的LacZ基因(transferrin targeted LacZ gene pegylated liposomes，Tf-PLs)在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)，尋找出適合臨床的安全有效的基因?qū)敕椒ā７椒?20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為靜脈導(dǎo)入組、動(dòng)脈導(dǎo)入組、側(cè)腦室導(dǎo)入組、鞘內(nèi)注射組和治療組，其中治療組分別將Tf-LacZ通過(guò)股靜脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、側(cè)腦室立體定向及鞘內(nèi)的方式注射入大鼠體內(nèi)。術(shù)后24和48h分別取腦(每項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)每組隨機(jī)選取8只大鼠)，光學(xué)顯微鏡下觀察LacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶(beta-gal)的表達(dá)，Real time-PCR比較不同組別LacZ mRNA的表達(dá)，試劑盒檢測(cè)β-半乳糖苷酶的活性。結(jié)果免疫組化提示動(dòng)脈導(dǎo)入組及靜脈導(dǎo)入組可以實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶在腦內(nèi)的廣泛性表達(dá)，并且動(dòng)脈導(dǎo)入組LacZ mRNA及β-半乳糖苷酶的表達(dá)高于靜脈組(P＜0．05)。側(cè)腦室及鞘內(nèi)注射組只能實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶的局限性表達(dá)，且LacZ mRNA及β-半乳糖苷酶的表達(dá)要低于動(dòng)脈及靜脈導(dǎo)入組(P＜0．05)。結(jié)論動(dòng)脈導(dǎo)入將外源基因轉(zhuǎn)入大鼠腦內(nèi)的效果最好，靜脈導(dǎo)入的效果優(yōu)于側(cè)腦室注射和鞘內(nèi)注射的方式。在可行性方面，經(jīng)過(guò)靜脈導(dǎo)入途徑是較為方便、易行、有效。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)鐵蛋白血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

血腦屏障(BBB)是一層將腦組織和血液系統(tǒng)分隔開(kāi)的物理屏障，其基本結(jié)構(gòu)成分是單層腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其相互間的緊密連接。在正常生理情況下只允許分子質(zhì)量＜600Da的脂溶性低分子通過(guò)，這一特性對(duì)于維持大腦內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定十分重要，但同時(shí)也使超過(guò)95%以上的治療藥物，尤其是最近發(fā)展很快的高分子生物藥物如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、多聚寡核苷酸、抗體等無(wú)法通過(guò)血腦屏障到達(dá)腦部發(fā)揮作用，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的瓶頸。因此跨血腦屏障的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究成為當(dāng)前腦類疾病治療的重點(diǎn)。在我們本項(xiàng)研究中，我們選取了可以與血腦屏障表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相結(jié)合的轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向脂質(zhì)體，將其包裹外源基因LacZ后，通過(guò)4種不同的方式注射至大鼠體內(nèi)，通過(guò)比較外源基因在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)情況，篩選出一種較為方便、快捷、有效的外源基因?qū)敕椒ā?/p>

材料與方法

1．試劑:pCMV-LacZ質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，GFAP-LacZ質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因公司合成;膽固醇氯甲酸酯(購(gòu)自上海晶純?cè)噭┯邢薰?;N，N-二甲基乙二胺(購(gòu)自日照力德士化工有限公司)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferin，Tf，購(gòu)自Sigma公司)、2-亞氨氫氯化硫醇Traut's試劑盒(購(gòu)自PIERCE公司);DSPEPEG-MAL、POPC、DSPE-PEG2000、DSPE(購(gòu)自Creative PEGWorks);PicoGreen核酸定量試劑盒、NanoOrange蛋白定量試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司);瓊脂糖Sepharose CL-4B、葡聚糖Sephadex G-25(購(gòu)自北京/東凱生物);質(zhì)粒大提試劑盒Maxiprep(購(gòu)自Qiagen，Chatworth，CA);LacZ Dectction Kit for Tissues(購(gòu)自Invivogen公司)，RNeasy Mini試劑盒和Beta-Glo Assay System試劑盒(購(gòu)自Promega公司)，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(Piece公司)。

2．儀器:燒瓶、夾熱套、攪拌器、Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)、SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)、LGJO．5冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)、KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、VORTEX-5旋渦混合器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)，ABI7900HT定量PCR儀等。

3．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:200～250g SPF級(jí)SD雄性大鼠120只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。無(wú)菌手術(shù)在北京協(xié)和醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行［SYXK(京)2005-0008］，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。將Tf-PLs分別通過(guò)股靜脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、側(cè)腦室立體定向、鞘內(nèi)注射4種方式注射入大鼠體內(nèi)，并設(shè)立對(duì)照組作為參照。

4．轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向脂質(zhì)體的制備:pGFAP啟動(dòng)子啟動(dòng)的LacZ表達(dá)質(zhì)粒pGFAP-LacZ質(zhì)粒的構(gòu)建與提純送上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成構(gòu)建。將33mmol/L的DC-膽固醇、33mmol/L的POPC(25．971mg/ml)、1．65mmol/L的DSPE -PEG2000(5．61mg/ml)、0．33mmol/L的DSPE-PEG-MAL (1．122mg/ml)各385μl混合后，室溫旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，加入4ml二氯甲烷復(fù)溶后加入1ml(200μg/ml)質(zhì)粒水溶液，渦旋振蕩5min，超聲5min，30℃旋轉(zhuǎn)蒸干氯仿，得到包裹pGFAP-LacZ質(zhì)粒的脂質(zhì)體。利用Traut's試劑盒，將Tf的氨基末端活化，連接至脂質(zhì)體的聚乙二醇長(zhǎng)鏈末端，構(gòu)建Tf-PLs。

5．組織化學(xué)染色:每組8只動(dòng)物分別于藥物注射后48h處死，用0．01mol/L的PBS和4%多聚甲醛以先快后慢的速度行心臟灌注。取腦置于4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，再分次浸泡于10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脫水至組織沉底。OCT膠包埋組織于恒冷冷凍切片機(jī)切片，切片厚度為12μm，每2張切片間隔70μm，鋪片于DEPC處理過(guò)的載玻片。將X-gal染色液滴加到切片上，孵箱中37℃孵育2～4h后封片鏡檢。

6．Real time PCR:藥物注射24h后每組8只大鼠過(guò)量麻醉處死，斷頭取腦及周?chē)鞴?，迅速放入凍存管液氮中保存。提取各組腦組織總RNA并通過(guò)RNeasy Mini試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)上下游PCR引物，LacZ基因上游引物為5'-TGGGAGGCTCAAAGCAAGAC-3'，下游引物為5'-TGACGACAAGGGACAGGTGAT-3'，β-肌動(dòng)蛋白上游引物為5'-CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3'，下游引物為5'-GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3'。利用ABI7900HT定量PCR儀，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。SDS 2．2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，并導(dǎo)出文件及圖像。利用管家基因β-肌動(dòng)蛋白對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行校正，得到相對(duì)定量結(jié)果。

7．β-半乳糖苷酶活性測(cè)定:藥物注射48h后每組處死8只大鼠并斷頭取腦，將腦組織液氮保存，蛋白裂解液裂解腦組織并且離心后得到腦組織上清液，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白量。將提取的組織蛋白上清液與Beta-Glo Assay溶液混合，避光室溫孵育1h，用熒光計(jì)中測(cè)定混合液的相對(duì)光單位(RLU)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并將RLU轉(zhuǎn)換成皮克(pg)，β-半乳糖苷酶的在各個(gè)器官中的表達(dá)量以皮克/毫克(pg/mg)蛋白的形式表示。

8．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)的方式表示。采用單向方差分析方法中的Bonferroni法進(jìn)行各組均數(shù)的多重比較。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1．轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向脂質(zhì)體(Tf-PLs)的特性:合成的脂質(zhì)體通過(guò)光散射的方法測(cè)定平均粒徑為100nm，計(jì)算得到的脂質(zhì)體包封率為70．23%～86．24%，平均78．23%。Tf偶聯(lián)率平均為69%。脂質(zhì)體的Zeta電位為30．2mV。

2．組織化學(xué)染色:動(dòng)脈導(dǎo)入組及靜脈導(dǎo)入組可以實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶在腦內(nèi)的廣泛性表達(dá)，動(dòng)脈導(dǎo)入組的表達(dá)強(qiáng)于靜脈導(dǎo)入組，側(cè)腦室及鞘內(nèi)注射組只能實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)的局部表達(dá)(圖1)。

圖1 LacZ基因表達(dá)產(chǎn)物在大鼠腦內(nèi)的組織化學(xué)染色

3．Real time PCR:藥物注射24h后，動(dòng)脈導(dǎo)入組LacZ基因mRNA相對(duì)量(22．391×10-6)高于靜脈導(dǎo)入組(19．182×10-6，P＜0．05)、側(cè)腦室(9．4263× 10-6，P＜0．05)及鞘內(nèi)注射組(8．732×10-6，P＜0．05)，靜脈導(dǎo)入組與側(cè)腦室及鞘內(nèi)注射組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)。側(cè)腦室組與鞘內(nèi)注射組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。

圖2 LacZ基因在大鼠腦內(nèi)mRNA的表達(dá)

4．β-半乳糖苷酶活性:藥物注射48h后，動(dòng)脈導(dǎo)入組β-半乳糖苷酶活性為0．91pg/mg，靜脈導(dǎo)入組為0．60pg/mg，側(cè)腦室為0．52pg/mg及鞘內(nèi)注射組為0．49pg/mg。動(dòng)脈導(dǎo)入組與靜脈導(dǎo)入組、側(cè)腦室及鞘內(nèi)注射組相比，具有顯著性差異(P＜0．05)。靜脈導(dǎo)入組與側(cè)腦室組及鞘內(nèi)注射組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)。側(cè)腦室組與鞘內(nèi)注射組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。

圖3 LacZ基因在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)

討論

由于血腦屏障的存在，因此我們將LacZ基因包裹于轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向脂質(zhì)體內(nèi)通過(guò)股靜脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、側(cè)腦室及鞘內(nèi)的方式，注射至大鼠體內(nèi)，觀察LacZ基因在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)，從而尋找一種方便、快捷，但又能夠?qū)崿F(xiàn)腦內(nèi)高效表達(dá)的一種給藥途徑。有文獻(xiàn)報(bào)道，在血腦屏障的血管內(nèi)皮表面可以表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體，偶聯(lián)有轉(zhuǎn)鐵蛋白的脂質(zhì)體可以攜帶外源基因，依靠配體、受體相結(jié)合的靶向作用，激發(fā)血管內(nèi)皮的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，使脂質(zhì)體跨越血腦屏障，進(jìn)入腦內(nèi)［1，2］。以往研究表明，在轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向脂質(zhì)體的協(xié)助下通過(guò)靜脈途徑可以將外源基因轉(zhuǎn)運(yùn)至腦內(nèi)，實(shí)現(xiàn)其在腦內(nèi)的廣泛性表達(dá)。在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)，將LacZ基因包裹至轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向脂質(zhì)體內(nèi)，通過(guò)靜脈注射的方式可以實(shí)現(xiàn)LacZ在腦內(nèi)的廣泛性表達(dá)［3～5］。但是，也有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)側(cè)腦室注射的方式，可以更好地實(shí)現(xiàn)外源基因在腦內(nèi)的表達(dá)。因此我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中將轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向脂質(zhì)體通過(guò)靜脈、動(dòng)脈、側(cè)腦室及鞘內(nèi)4種方式，注射至大鼠體內(nèi)，通過(guò)組織化學(xué)染色、目標(biāo)基因mRNA檢測(cè)以及目標(biāo)基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，比較4種注射途徑在轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因應(yīng)用過(guò)程中的優(yōu)缺點(diǎn)［6，7］。

在組織化學(xué)染色中，我們發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈導(dǎo)入組可以更好地實(shí)現(xiàn)LacZ基因在顱內(nèi)的廣泛性表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度要高于靜脈導(dǎo)入組。靜脈導(dǎo)入組雖然也可以實(shí)現(xiàn)顱內(nèi)的廣泛性表達(dá)，但是其表達(dá)強(qiáng)度要低于動(dòng)脈導(dǎo)入組，考慮原因是通過(guò)靜脈注射后，脂質(zhì)體要經(jīng)過(guò)全身的血液循環(huán)，從而會(huì)導(dǎo)致部分脂質(zhì)體的損失。雖然我們合成的脂質(zhì)體能夠在血液中維持一定的穩(wěn)態(tài)，避免吞噬細(xì)胞將其作為外來(lái)異物清除掉，但是有文獻(xiàn)報(bào)道，脂質(zhì)體仍然會(huì)在脾臟、肺臟中進(jìn)行沉積，從而導(dǎo)致脂質(zhì)體的損失，影響其攜帶外源基因進(jìn)入腦內(nèi)的表達(dá)［8～13］。側(cè)腦室注射組和鞘內(nèi)注射組只能實(shí)現(xiàn)腦室局部的局限性表達(dá)，在遠(yuǎn)離腦室的部位很難發(fā)現(xiàn)LacZ基因的表達(dá)，因此這兩種方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，特別是大鼠缺血性腦卒中的實(shí)驗(yàn)中，由于腦梗死后缺血半暗帶分布的廣泛性，治療基因只是在局部表達(dá)，很難實(shí)現(xiàn)滿意的治療效果。因此，動(dòng)脈和靜脈導(dǎo)入方法使外源基因在空間分布上的優(yōu)越性，使這兩種方式成為比較好的外源基因?qū)胪緩健?/p>

在LacZ基因mRNA檢測(cè)及表達(dá)產(chǎn)物β-半乳糖苷酶活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)中，我們同樣發(fā)現(xiàn)通過(guò)動(dòng)脈及靜脈途徑導(dǎo)入的方法，與側(cè)腦室及鞘內(nèi)注射的方法比較，可以更高效地表達(dá)目的基因。但是，在我們的實(shí)驗(yàn)中，由于我們提取的是大鼠全部腦組織，在此基礎(chǔ)上對(duì)LacZ基因的mRNA及β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行測(cè)定，因此掩蓋了側(cè)腦室及鞘內(nèi)注射途徑在局部部位的高表達(dá)的優(yōu)勢(shì)，即其在數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)。因此我們認(rèn)為，根據(jù)不同動(dòng)物模型的需要，如果是治療廣泛性病變，采用動(dòng)脈途徑或靜脈途徑可以實(shí)現(xiàn)較好的空間分布性，如果治療的病變較為局限，可以采納側(cè)腦室或鞘內(nèi)注射的方式。

此外，動(dòng)脈途徑和靜脈途徑比較，由于動(dòng)脈途徑需要暴露大鼠的頸總動(dòng)脈系統(tǒng)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的創(chuàng)傷較大，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的顯微解剖和手術(shù)技巧要求較高。而靜脈途徑只需要暴露大鼠股靜脈，甚至技術(shù)熟練的實(shí)驗(yàn)人員可以通過(guò)尾靜脈注射的方式給藥，從而節(jié)約大量的時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。側(cè)腦室注射需要涉及到立體定向裝置和專門(mén)的穿刺針，對(duì)于手術(shù)技術(shù)的要求更高。因此，在滿足實(shí)驗(yàn)要求的前提下，采取靜脈導(dǎo)入外源基因是一種比較便捷、高效的注射途徑。

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(收稿:2012-06-29)

(修回:2012-07-08)

Correlations Between Gene Transfer Approaches and Intracerebral Gene Expression．

Zhao Hao，Li Yunjun，Chen Lihua，Wei Qun，Dai Yiwu，Xu Ruxiang，Wang Renzhi．Bayi Brain Hospital Affilated With The Military General Hospital of Beijing PLA，Beijing 100700，China

ObjectiveTo compare intracerebral expression of transferrin targeted LacZ gene pegylated liposomes(Tf-PLs)transferred by different approaches via the femoral vein，internal carotid artery(ICA)，lateral ventricle(LV)and intrathecal routes in rats，in an attempt to seek a safe and effective approach for gene transfer appropriate for clinical use．MethodsMale SD rats were randomized in to four groups and Tf-LacZ was injected into the rats via the femoral vein，ICA，LV and intrathecal routes，respectively．Eight animals from each group were sacrificed and the brains were removed 24 and 48 h after Tf-LacZ injection．The expression of LacZ encoded βgalactosidase(β-gal)was observed under an optical microscope．LacZ mRNA expressions in different groups at the designated time points were detected by RT-PCR，and the expressions of β-gal were detected by Reagent kit．The results obtained were compared．ResultsExtensive expression of β-gal was achieved in the femoral vein and ICA groups，and the expression of LacZ mRNA in the CA group was significantly high than that in the femoral vein group(P＜0．05)．Only local expression was achieved in the LV and intrathecal groups，and the expressions of LacZ mRNA and β-gal activity in these two groups were significantly lower than those in the femoral vein and ICA groups(P＜0．05)．ConclusionThe effect of transferring exogenous gene into the rat brain was the best in the arterial injection group，and the effect in the venous injection group was better than that in the LV and intrathecal injection groups．The venous transfer route is easier，more convenient and more effective than the other routes in terms of practical feasibility．

Lipiosomes;Transferrin;Blood brain barrier;Transfer approach

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81100917)

100700北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院(趙浩、李運(yùn)軍、陳立華、魏群、戴宜武、徐如祥);100730中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院(王任直)

徐如祥，電子信箱:zjxuruxiang@163．com