乙肝病毒X蛋白通過激活JAK2/STAT3信號通路調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞凋亡

何 平， 李 丹， 李德天， 馮國和

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1腎內(nèi)科， 2感染科, 遼寧 沈陽 110004)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)估計全球范圍內(nèi)約有3.5億人是慢性HBV攜帶者[1]。長期以來中國、東南亞和熱帶非洲為高流行區(qū)。自1971年Combes等首先描述了第1例具有持續(xù)HBsAg血癥的患者發(fā)生了膜性腎病以來，腎小球腎炎已被公認(rèn)為是HBV感染引起的最常見肝外病變，又稱乙型病毒肝炎相關(guān)性腎炎(HBV-associated glomerulonephritis，HBVGN)。既往認(rèn)為，HBVGN的發(fā)病機(jī)制是HBV抗原和抗體形成的循環(huán)免疫復(fù)合物和原位免疫復(fù)合物在腎組織的沉積。但目前認(rèn)為，HBV因其泛嗜性而直接感染腎組織細(xì)胞，產(chǎn)生病毒殺細(xì)胞效應(yīng)，也是HBVGN重要的發(fā)病機(jī)制之一[2]。

HBV X蛋白(HBV X protein,HBx)基因是HBV基因組中最小的開放性讀碼框，編碼長度為154個氨基酸的蛋白。X蛋白是一種多功能蛋白，能夠激活多種細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)凋亡等。然而，針對不同種類的細(xì)胞及不同的外界條件，HBx調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制也各不相同[3]。大量研究表明HBx可以激活JAK/STAT、Ras-Raf-MAPK、p38 MAPK、JNK、PI3K、Src酪氨酸激酶、Pyk-2等信號通路[4-5],誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡[6-8]。

細(xì)胞凋亡是基因控制和酶促反應(yīng)下按一定程序進(jìn)行的細(xì)胞主動性死亡。天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)是凋亡產(chǎn)生的最終效應(yīng)酶。凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax位于caspase-3的上游，Bax和Bcl-2二者的表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值是影響細(xì)胞生存的重要因素[9-11]。而Bcl-2和Bax的表達(dá)又受到JAK/STAT信號通路的調(diào)控[12]。JAK/STAT信號通路是一條重要的細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)。JAK是內(nèi)源性蛋白酪氨酸激酶，它可在細(xì)胞因子受體與相應(yīng)配基結(jié)合后活化，進(jìn)而使胞漿中的STAT分子磷酸化，2個磷酸化的STAT分子形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，在核內(nèi)它們與靶基因啟動子中特異的DNA序列結(jié)合而誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。研究表明，多種急、慢性腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展都與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系[13-16]。既往在針對HBVGN腎組織的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的主要發(fā)生部位是近端及遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞，腎小球少見，同時凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值也發(fā)生了相應(yīng)的變化；但JAK/STAT信號通路的活化情況及其在凋亡中的作用并不清楚[17-19]。為了進(jìn)一步明確HBVGN中HBx的致病機(jī)制及JAK/STAT信號通路的活化在腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用，我們將HBx基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)中，檢測JAK/STAT信號通路的激活及對HK-2細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為HBVGN發(fā)病機(jī)制的研究提供新的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

HK-2細(xì)胞購自北京中原公司(ATCC中國大陸總代理)。用Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層貼壁生長，實驗均取對數(shù)生長期細(xì)胞。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶瓶底(一般2～3 d)后，無菌條件下用0.25%胰酶消化傳代。

實驗分兩部分。第一部分實驗分5組: (1)對照組，(2)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)組(空質(zhì)粒組)，(3)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HBx 24 h組(HBx 24 h組)，(4)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HBx 48 h組(HBx 48 h組)和(5)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pc-DNA3.1(+)HBx 72 h組(HBx 72 h組)。第二部分實驗分6組: (1)對照組，(2)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)組，(3)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HBx組，(4)對照組+AG490組，(5)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)+AG490組，(6)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HBx +AG490組,其中(4)～(6)組的細(xì)胞用AG490(Sigma)孵育24 h。

2 主要方法

2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用Lipofectamine? LTX & Plus轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)，按照說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在實驗中，用與pcDNA3.1(+)-HBx大小接近的pEGFP-C1熒光質(zhì)粒(Clontech)共轉(zhuǎn)染，間接評估目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。

2.2Western blotting法檢測目標(biāo)蛋白 收獲細(xì)胞后，用含有PMSF的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。細(xì)胞提取物用BCA法測定濃度。等量上樣，用8%及12% SDS-PAGE分離。之后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后，分別加入 Ⅰ 抗：HBx(1∶1 000，Chemicon)、JAK2(1∶2 000，CST)、p-JAK2(1∶1 500，CST)、STAT3(1∶1 000，CST)和p-STAT(1∶2 000，CST)，4 ℃搖床孵育過夜。加入相應(yīng)Ⅱ抗，進(jìn)行ECL反應(yīng)。一次性完成定影、顯影及圖像分析系統(tǒng)測定條帶的灰度值。

2.3熒光顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡 通過Hoechst 33342(Sigma)對細(xì)胞核染色觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。HK-2細(xì)胞以5×105的密度接種于6孔板中爬片過夜, 分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-HBx，并設(shè)對照組。分別于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。取出細(xì)胞爬片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS再洗3次，加入Hoechst 33342熒光染料(5 mg/L)37 ℃避光孵育8 min，再用PBS洗3次。盡快于熒光顯微鏡下觀察、照相。

應(yīng)用透射電鏡觀察HK-2細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。細(xì)胞以5×105的密度接種于6孔板中過夜，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-HBx，并設(shè)對照組。分別于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。后胰酶消化，收集細(xì)胞，置于2.5%戊二醛(4 ℃保存)中固定。固定后的組織經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液中充分漂洗，用1%鋨酸(OsO4)雙固定24 h，漂洗后乙醇梯度脫水，丙酮置換、浸透，環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋、聚合，LKB超薄切片機(jī)制成超薄切片，于透射電鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2.4Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒購自中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。HK-2細(xì)胞以5×108/L接種于6孔板中培養(yǎng)24 h貼壁后, 分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-HBx，并設(shè)對照組。分別于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。用無EDTA胰酶消化收集細(xì)胞。離心、PBS洗滌細(xì)胞3次。用500 μL 1× binding buffer懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×109/L。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，4 ℃冰箱避光孵育30 min。加入5 μL PI后輕輕混勻，4 ℃避光孵育5 min。隨即用流式細(xì)胞儀檢測(最遲1 h內(nèi))。結(jié)果用CellQuest專業(yè)軟件獲取分析數(shù)據(jù)。Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)可將實驗樣本中正常、壞死和凋亡細(xì)胞區(qū)分開。以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點圖，細(xì)胞分為4個象限，左下象限為 Annexin V-FITC-、PI-,代表正?；罴?xì)胞；左上象限為 Annexin V-FITC-、PI+,代表機(jī)械損傷細(xì)胞；右下象限為Annexin V-FITC+、PI-,代表早期凋亡細(xì)胞；右上象限為Annexin V-FITC+、PI+,代表晚期凋亡/壞死細(xì)胞。分別計數(shù)各組細(xì)胞凋亡率并進(jìn)行組間比較。實驗重復(fù)3次。

2.5細(xì)胞增殖的測定 CCK-8(中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)法檢測HBx對HK-2細(xì)胞增殖的作用：消化收集對數(shù)增殖期細(xì)胞并調(diào)整成濃度為1×108/L的細(xì)胞懸液，接種于3張96孔板，每孔100 μL。接種過夜后,鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞貼壁良好。細(xì)胞分3組：分別為對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx組。實驗設(shè)不加細(xì)胞只有全培養(yǎng)基的空白對照，比色時以空白對照校零。細(xì)胞在37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。結(jié)束培養(yǎng)前2 h每孔加CCK-8 10 μL。于450 nm波長處檢測每孔吸光度值(A值)。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞生存率及增殖抑制率按如 下公式計算：生存率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100%;抑制率(%)=(1-生存率)×100%。

2.6免疫熒光觀察 各組細(xì)胞在蓋玻片上生長融合到95%～100%時，從孵箱中取出；用PBS洗后，4%甲醛固定;0.5%Triton X-100在37 ℃溫箱透化20 min;血清封閉后，分別加Ⅰ抗STAT3(1∶50)和p-STAT3(1∶100),濕盒里4 ℃過夜;加Ⅱ抗后，DAPI復(fù)染，95%甘油封片;共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)；相關(guān)分析采用直線相關(guān)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

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結(jié) 果

1 目的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HBx的轉(zhuǎn)染效率及HBx在HK-2細(xì)胞中的表達(dá)

利用共聚焦顯微鏡觀察到pcDNA3.1(+)-HBx的轉(zhuǎn)染效率大概在45%～55%左右，見圖1。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)HBx 24 h、48 h及72 h組在17 kD出現(xiàn)一條明顯條帶,表明HBx在HK-2細(xì)胞有陽性表達(dá)。轉(zhuǎn)染目的基因24 h及48 h，蛋白表達(dá)量無明顯區(qū)別(P>0.05)。轉(zhuǎn)染目的基因72 h后，蛋白表達(dá)水平最高，與24 h、48 h比較，差異顯著(P<0.05)?？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染組未見相應(yīng)蛋白條帶，見圖2A。

Figure 1. Plasmid transfection efficiency in HK-2 cells observed under confocal microscope (×100). A: fluorescence microscopy; B:confocal microscopy.

對照組、空質(zhì)粒組及pcDNA3.1(+)-HBx組轉(zhuǎn)染24 h后，加用AG490再孵育24 h。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pc-DNA3.1(+)-HBx組及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HBx+AG490組均有HBx表達(dá)，且表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，見圖2B。這說明AG490不影響HBx蛋白的表達(dá)。

2 倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化

對照組細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞密度較大，形態(tài)基本正常；而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx后各時點各組出現(xiàn)細(xì)胞增殖受抑，細(xì)胞密度變小，凋亡細(xì)胞的體積變小、變圓；細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、脫落，見圖3。

Figure 2. Protein expression of HBx in HK-2 cells at different time points after transfection (A) and in the presence or absence of AG490 (B) detected by Western blotting. Mean±SD. n=5. #P<0.05, ##P<0.01 vs control.

Figure 3. Morphological changes of the HK-2 cells with different treatments observed under inverted microscope (×100).

3 轉(zhuǎn)染目的基因HBx后，p-JAK2及p-STAT3水平明顯增高；加用AG490后，p-JAK2及p-STAT3水平較前明顯下降

Western blotting分析顯示對照組細(xì)胞中JAK2和STAT3均有表達(dá)，且JAK2及STAT3有少量磷酸化，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與對照組無明顯差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx 后24 h，p-JAK2及p-STAT3的表達(dá)均明顯增高，至轉(zhuǎn)染72 h達(dá)到高峰；轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1(+)-HBx后各組間及與對照組間均有顯著差異(P<0.05)。JAK2及STAT3在轉(zhuǎn)染后24 h表達(dá)也明顯增高，隨著轉(zhuǎn)染時間延長，蛋白表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)趨勢，轉(zhuǎn)染72 h，達(dá)到高峰。各組間及與對照組比較，均有顯著差異(P<0.05)，見圖4。

細(xì)胞免疫熒光觀察結(jié)果顯示STAT3和 p-STAT3 2種信號蛋白在各組腎小管上皮細(xì)胞均有表達(dá)。在對照組中STAT3和p-STAT3 蛋白均主要表達(dá)于胞漿，且p-STAT3 蛋白表達(dá)很弱；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx后各組p-STAT3 蛋白水平均明顯增加，并且隨時間延長表達(dá)增強(qiáng)；在 72 h 時表達(dá)水平最高，在胞漿及胞核均有較高表達(dá)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h后，STAT3蛋白水平亦明顯增加，并且隨時間延長表達(dá)增強(qiáng)，在72 h達(dá)高峰，主要在胞漿表達(dá)，見圖5、6。

Figure 4. The protein expression of JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 in HK-2 cells at different time points after transfection with HBx (detected by Western blotting). Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control.

Figure 5. Immunofluorescence observation of p-STAT3 expression in HK-2 cells at different time points after transfection with HBx (×400).

加用AG490孵育后(HBx 48 h+AG490組)，與未加入組(HBx 48 h組)相比， p-JAK2、p-STAT3、JAK2及STAT3的表達(dá)均有所下降(P<0.05)。而對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、對照組+AG490組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒+AG490組上述4種信號蛋白的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，見圖7。

4 轉(zhuǎn)染目的基因HBx對HK-2細(xì)胞增殖的作用

設(shè)對照組細(xì)胞生存率為100%。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞生存率與對照組無明顯差別(P>0.05)，提示對細(xì)胞無明顯增殖抑制作用。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h 后，細(xì)胞生存率明顯下降，提示HBx對細(xì)胞增殖有抑制作用，抑制率為(14.08±2.14)%，與對照組相比，差異顯著(P<0.05)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-(+)HBx 48 h 后，細(xì)胞的增殖抑制率顯著增加，達(dá)到(31.33±2.24)%，與對照組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h組比較，差異顯著(P<0.05)。轉(zhuǎn)染72 h后，細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到(35.27%±1.10)%，與對照組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h組比較，差異顯著(P<0.05)；但與轉(zhuǎn)染48 h組比較無明顯差異(P>0.05)，見圖8。

Figure 6. Immunofluorescence observation of STAT3 expression in HK-2 cells at different time points after transfection with HBx (×400).

5 轉(zhuǎn)染目的基因HBx引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡

應(yīng)用Hoechst 33342染色、透射電鏡及流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-HBx后HK-2細(xì)胞的凋亡。圖9顯示，應(yīng)用透射電鏡觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。對照組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的細(xì)胞核近于圓形，核仁偏位存在，核膜清晰，胞質(zhì)內(nèi)有大量核糖體，線粒體和一些粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞表面見有微絨毛。轉(zhuǎn)染目的基因HBx后24 h組、48 h組和72 h組可見核仁不規(guī)則，有凹陷，核膜水腫，核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚、邊集。凋亡晚期有核膜溶解，核碎裂。應(yīng)用Hoechst 33342染色觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后凋亡形態(tài)學(xué)改變，見圖10A。對照組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞核輪廓清晰，細(xì)胞核正常，可見核分裂。pcDNA3.1(+)-HBx 轉(zhuǎn)染24 h組、48 h組和72 h組HK-2可見核碎裂、固縮，部分核溶解，染色質(zhì)邊集等，并且隨著轉(zhuǎn)染時間延長，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核改變加重。圖10A中的白色橢圓形圈出典型的凋亡核改變，其放大圖像見圖10B。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對照組HK-2細(xì)胞的凋亡率為 (5.81±1.62)%；轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞的凋亡率為 (5.92±1.09)%；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h組細(xì)胞的凋亡率為(15.18±1.98)%；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx 48 h組細(xì)胞的凋亡率為(20.62±2.23)%；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx 72 h組細(xì)胞的凋亡率為 (23.83±2.16)%。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組凋亡率較對照組無明顯變化。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h后細(xì)胞的凋亡率較對照組顯著增高，差異顯著(P<0.05)。其中，轉(zhuǎn)染48 h組較轉(zhuǎn)染24 h組凋亡率顯著增高，差異顯著(P<0.05)。但轉(zhuǎn)染后48 h與轉(zhuǎn)染后72 h無顯著差異(P>0.05)，見圖11。

Figure 7. The effects of AG490 on the protein expression of JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 in HK-2 cells at 48 h after transfection with HBx. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control.

圖12顯示，對照組細(xì)胞的凋亡率為(8.62±1.58)%；轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞的凋亡率為(8.34±1.25)%；對照組+AG490組細(xì)胞的凋亡率為(6.30±2.01)%；轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組+AG490組細(xì)胞的凋亡率為(7.39±1.74)%；對照組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組加與不加AG490凋亡率無明顯差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)HBx 48 h后細(xì)胞的凋亡率顯著增加，為(23.85±1.42)%；加用AG490孵育后細(xì)胞凋亡率顯著下降為(14.34±2.63)%，但與對照組相比凋亡率仍明顯增高，均有顯著差異(P<0.05)。

Figure 8. Effect of HBx gene transfection on the viability of HK-2 cells. Mean±SD. n=5. #P<0.05 vs control.

Figure 9. Ultrastructural changes of the HK-2 cells at different time points after transfection with HBx observed under transmission electronic microscope (×4 000).

Figure 10. Hoechst 33342 staning revealed apoptotic morphologic variations in the HK-2 cells transfected with HBx gene. A：the white ovals indicate the typical apoptotic changes of the nuclear morphology (×400)； B: image amplification of the areas in the white ovals from A. a: normal nucleus; b～h: apoptotic nuclei.

Figure 11. The apoptotic rates of the HK-2 cells at different time points after transfection with HBx gene determined by flow cytometry. Mean±SD. n=5. #P<0.05 vs control.

討 論

HBVGN已被公認(rèn)為是HBV感染引起的最常見肝外病變， 其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。近年來有較多研究報道HBV相關(guān)核酸分子在腎組織病變的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HBVGN患者腎臟中存在HBV-DNA，HBV-RNA 和閉合環(huán)狀雙鏈DNA(cccDNA)，甚至完整的病毒顆粒[20-22]，進(jìn)一步支持了HBV可直接感染腎臟并原位復(fù)制而致病的觀點。

既往Clippinger等[3,23]利用原代培養(yǎng)肝細(xì)胞，先后研究HBx蛋白在線粒體的定位及對肝細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞中，HBx既能抗凋亡又能刺激凋亡，主要是根據(jù)NF-κB信號通路的狀態(tài)。但針對腎小管上皮細(xì)胞，HBx蛋白與腎小管上皮細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系及其信號通路迄今為止尚未明確。

Figure 12. The effect of AG490 on the cell apoptotic rates in the HK-2 cells tranfected with HBx gene. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control.

凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞程序性死亡，是從細(xì)胞外信號短-細(xì)胞內(nèi)信號通路短-凋亡相關(guān)基因和酶作用的復(fù)雜過程[25]。各種細(xì)胞外因素對細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)主要與細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化密切相關(guān)，其中JAK/STAT途徑近年來倍受關(guān)注。JAK/STAT信號途徑是細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一，對細(xì)胞的生理和病理反應(yīng)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[25]。

為了驗證JAK2/STAT3信號通路活化與HBx蛋白之間的關(guān)系，我們將HBx基因轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞(HK2細(xì)胞株)中，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)及Western blotting方法檢測JAK2/STAT3信號通路活化。結(jié)果顯示，在體外，HBx可以增加p-STAT3表達(dá)，活化JAK2/STAT3信號通路。進(jìn)一步驗證了JAK2/STAT3信號通路活化參與了HBVGN的發(fā)生發(fā)展。

Deng等[26-27]用HBV-DNA陽性血清體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞，可誘導(dǎo)其凋亡；且細(xì)胞凋亡比例與HBV的DNA水平呈正相關(guān)。不可控制的腎小管上皮細(xì)胞凋亡會引起腎臟損傷進(jìn)而可能導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[28]。在本研究中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 體外培養(yǎng)細(xì)胞實驗更深入證實了HBx能夠?qū)е翲K2細(xì)胞凋亡，且凋亡與JAK2/STAT3信號通路活化有關(guān)。最近，一些學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞的密度或者融合狀態(tài)可能會影響不同細(xì)胞的生物學(xué)行為和反應(yīng)，包括細(xì)胞凋亡等[29-30]。而在本研究中，所有實驗均在細(xì)胞亞融合狀態(tài)下完成(約70%融合度)，且設(shè)置了空載體轉(zhuǎn)染對照組，所以我們得出的結(jié)果是可信的。

為了進(jìn)一步證明JAK2/STAT3信號通路活化確實參與了腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，我們在實驗中使用了JAK/STAT信號通路阻斷劑AG490。AG490是JAK2特異性抑制劑，可有效抑制JAK2酪氨酸磷酸化并且阻斷其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子STAT的活化[31]。AG490處理后，HBx基因轉(zhuǎn)染所致HK-2細(xì)胞凋亡率明顯下降；與此同時，p-JAK2及p-STAT3表達(dá)水平均有所降低。這些結(jié)果說明JAK/STAT信號通路活化參與了HBV感染所致腎臟損傷中。

總之，我們的研究表明，JAK2/STAT3信號通路活化參與到HBx致腎小管上皮細(xì)胞凋亡過程中。并為HBVGN發(fā)病機(jī)制中病毒直接損傷作用提供了實驗依據(jù)。

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