不同功率超聲波對蕓豆蛋白理化和功能性質(zhì)的影響

劉高梅 任海偉

(山西輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工工程系1，太原 030013)

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院2，蘭州 730050)

蕓豆(Phaseolus vulgaris Linn.sp.)學(xué)名菜豆，是普通菜豆(如小黑蕓豆、小白蕓豆等)和多花菜豆(如圓奶華蕓豆 H、N、D、X等)的總稱，屬豆科(Leguminosae)菜豆屬(Phaseolus L.)的小宗雜糧作物［1］。蕓豆蛋白(KBP)中富含天門冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和亮氨酸等氨基酸，其氨基酸評分(AAS)、化學(xué)評分(CS)、必需氨基酸指數(shù)(EAAI)均高于大豆蛋白或乳清蛋白，必需氨基酸組成符合FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)模式，是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白和功能添加劑原料［2］。

蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)在提高食品品質(zhì)方面十分重要，蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)主要由其結(jié)構(gòu)決定。常見的蛋白質(zhì)改性方法有物理法、生物酶法和化學(xué)法等，物理改性是利用熱、電、磁、機(jī)械能等物理作用形式對蛋白的功能性加以改善，具有費用低、安全性好、作用時間短、對產(chǎn)品營養(yǎng)成分影響較小等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊［3］。物理改性方法主要有超聲波［4］、超高壓［5］、高壓脈沖［6］、微波［7］、熱誘導(dǎo)聚合［8］等，其中超聲波技術(shù)具有作用時間短、操作簡單易控制及能耗較低等優(yōu)點，已被用于改善麥胚清蛋白［4］、小麥胚芽球蛋白［9］、大豆?jié)饪s蛋白［10］、小麥面筋蛋白［11］等植物蛋白的功能性質(zhì)。然而，關(guān)于超聲波處理對蕓豆蛋白理化和功能性質(zhì)影響的研究尚未見報道。

本試驗研究了經(jīng)不同功率超聲波處理前后的KBP紫外光譜、熒光光譜、溶解度、吸油性、起泡性能和乳化性能的變化規(guī)律，以期為探索超聲波技術(shù)改善KBP理化性質(zhì)和功能性質(zhì)的方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

涇川白蕓豆，市售，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.47%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.56%(以干基計)。

JY92－2超聲波細(xì)胞破碎儀:寧波新芝生物科技股份有限公司;TGL－16高速臺式冷凍離心機(jī):湘儀離心機(jī)廠;Cary50紫外－可見分光光度計:美國瓦里安中國有限公司;FD－1－55冷凍干燥機(jī):北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;960MC熒光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蕓豆蛋白(KBP)的提取

蕓豆精選、去皮烘干后粉碎，經(jīng)石油醚脫脂后過60目篩，低溫干燥得蕓豆粉。蕓豆粉以1∶10(g/mL)的料液比加入蒸餾水，在50℃、pH 9.0條件下恒溫攪拌提取1 h，然后3 000 r/min離心20 min，沉淀物再以1∶8(g/mL)比例提取2次。合并3次上清液，用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 4.4，然后4 000 r/min 離心15 min，水洗沉淀 3次，用 0.5 mol/L NaOH 調(diào)至pH 7.0，攪拌使沉淀復(fù)溶后，倒入透析袋中，4℃下透析48 h后，冷凍干燥，所得產(chǎn)品即為冷凍干燥得到蕓豆蛋白［12］。

1.2.2 超聲波處理方法

取適量樣品溶液，置于超聲波細(xì)胞破碎儀中處理 5 min，超聲波功率分別為 100、200、300、400、500、600 W，處理后的樣品進(jìn)行理化性質(zhì)和功能性質(zhì)分析。

1.2.3 紫外光譜掃描

準(zhǔn)確稱取0.5 g KBP溶于600 mL蒸餾水中，攪拌均勻，5 000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行超聲波處理，處理后的樣品在200～800 nm范圍用紫外－可見分光光度計掃描。

1.2.4 熒光光譜掃描

準(zhǔn)確稱取0.5 g KBP溶于600 mL蒸餾水中，攪拌均勻，5 000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行超聲波處理，處理后的樣品用熒光分光光度計掃描，掃描條件為激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長400～800 nm。

1.2.5 功能性質(zhì)的測定

1.2.5.1 溶解度的測定

配制1%的蛋白溶液，室溫攪拌30 min，然后3 000 r/min離心20 min，用半微量凱氏定氮法測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)濃度占總蛋白質(zhì)濃度的比例［13］。

1.2.5.2 起泡性能的測定

配制2%的蛋白溶液，在10 000 r/min條件下攪打1 min，迅速倒入500 mL量筒中，泡沫體積記為起泡性。靜置10 min后，再次測量泡沫體積，記為泡沫穩(wěn)定性［11］。

1.2.5.3 乳化性能的測定

配制3%的蛋白溶液50 mL，調(diào)節(jié)至pH 7.0，在12 000 r/min條件下室溫均質(zhì)30 s，加入50 mL大豆油，再均質(zhì)2 min，迅速將乳化液倒入2個50 mL的離心管中，2 700 r/min離心5 min，測量乳化層體積。上述方法所得混合液80℃保溫30 min，冷卻至室溫后2 700 r/min離心5 min，取出后測量乳化層體積［14］。計算乳化性(EA)和乳化穩(wěn)定性(ES)。

1.2.5.4 吸油性的測定

稱取0.5 g蛋白(精確到0.001)和10 mL大豆油于離心管中混勻，室溫靜置30 min，然后8 000 r/min離心30 min，測定上清液體積，體積減少量即為樣品吸油量。吸油性表示為每克樣品吸附油的體積［15］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗，并取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對KBP 紫外光譜的影響

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收主要是由于色氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)對紫外光的吸收，其次是苯丙氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)以及肽鍵對紫外光的吸收［16］。超聲波處理對KBP紫外光譜的影響如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)超聲波功率≤500 W時，超聲波處理后的KBP紫外吸光度均出現(xiàn)了不同程度降低。這可能是因為，蛋白分子中二硫鍵的增加或巰基的減少，導(dǎo)致蛋白分子折疊，蛋白表面生色基團(tuán)的減少引起紫外吸光度降低，這說明經(jīng)超聲波處理后的KBP空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。當(dāng)超聲功率為600 W時，紫外吸光度明顯高于未處理組(0 W)，隨著超聲波功率的提高，蛋白肽鏈伸展開來，從有序的折疊態(tài)變?yōu)闊o序的去折疊態(tài)，以致本來被包含在內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的疏水基團(tuán)裸露，使吸收強(qiáng)度增加［17］。

圖1 超聲波功率對蕓豆蛋白紫外光譜的影響曲線

2.2 超聲波處理對KBP熒光光譜的影響

超聲波處理對KBP熒光光譜的影響如圖2所示。由于KBP中色氨酸和酪氨酸的存在使其具有內(nèi)源熒光，在380 nm激發(fā)波長下，KBP的最大發(fā)射波長為560 nm。KBP經(jīng)超聲波處理后，熒光光譜的最大發(fā)射峰稍有藍(lán)移，熒光強(qiáng)度減弱或增強(qiáng)，但峰形未變，表明超聲波處理沒有破壞蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，僅使疏水腔結(jié)構(gòu)和發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生了不同程度的改變，疏水性增強(qiáng)。當(dāng)超聲波功率在100～500 W范圍內(nèi)，經(jīng)超聲波處理的KBP熒光強(qiáng)度明顯低于未處理組(0 W);超聲波功率為600 W時的KBP熒光強(qiáng)度則高于未處理組(0 W)。由圖2還可看出，隨著超聲功率的提高，激發(fā)熒光強(qiáng)度逐漸增加。因為，隨著功率的增加，超聲波對介質(zhì)產(chǎn)生的空穴效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和超混合效應(yīng)等作用增強(qiáng)，促使蛋白分子伸展，暴露出不同的生色基團(tuán)，從而改變了熒光強(qiáng)度的大小。另外，蛋白分子整體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、芳香族氨基酸和熒光生色基團(tuán)分布不均、蛋白分子伸展或折疊方式不同，在超聲處理下都會引起蛋白熒光強(qiáng)度的差異［18］。

圖2 超聲波功率對蕓豆蛋白熒光光譜的影響

2.3 超聲波處理對KBP溶解度的影響

蛋白質(zhì)的溶解性與功能特性存在密切聯(lián)系，通過蛋白質(zhì)的溶解性來體現(xiàn)其他的功能特性。因此，溶解度是蛋白的重要功能特性之一［19］。由圖3可知，當(dāng)超聲波功率在0～300 W范圍內(nèi)，KBP溶解度與超聲波功率呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)超聲波功率大于300 W時，溶解度增幅變緩，漸趨平穩(wěn)。因為，一方面，KBP中的谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸含量較高，經(jīng)超聲波處理后，其分子發(fā)生了伸展，這些氨基酸的充分暴露有利于溶解度的提高。另一方面，蛋白質(zhì)中的自由氨基群能和鄰近羧基群發(fā)生靜電引力，使蛋白分子聚集，溶解度下降;超聲波處理能夠打斷自由氨基群和鄰近羧基群之間的聯(lián)系，使溶解度得到提高［9］。再者，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)打開蛋白聚集體的同時打斷了蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)，形成溶于水的非共價鍵分子，與溶劑水的相互作用力加強(qiáng)，使其溶解度增加［20］。上述綜合作用，使得蛋白質(zhì)中的親水性氨基酸殘基向蛋白質(zhì)外部遷移，致使蛋白質(zhì)水合能力加強(qiáng)，溶解度提高。

圖3 超聲波功率對蕓豆蛋白溶解度的影響

2.4 超聲波處理對KBP起泡性能的影響

由圖4可知，隨著超聲波功率的增加，KBP的起泡性和起泡穩(wěn)定性呈先增后減的趨勢，當(dāng)超聲波功率為500 W時，起泡性和起泡穩(wěn)定性達(dá)到最大，分別134.5%和146.8%。一方面，超聲波處理改變了KBP的表面疏水性，而表面疏水基團(tuán)能夠促進(jìn)形成水－空氣界面;同時，表面疏水性增加意味著蛋白分子發(fā)生了伸展，而適度伸展的蛋白分子間能形成更為穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和界面膜，使超聲波處理后KBP的起泡性能增強(qiáng)。另一方面，當(dāng)超聲波功率進(jìn)一步增大時，KBP分子表面疏水性降低，這樣由蛋白分子間相互作用形成的穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和界面膜遭到破壞，產(chǎn)生的泡沫界面膜由于缺乏韌性而容易破裂，導(dǎo)致KBP的起泡性和起泡穩(wěn)定性開始下降［4］。

圖4 超聲波功率對蕓豆蛋白起泡能力研究

2.5 超聲波處理對KBP乳化性能的影響

蛋白質(zhì)分子的兩親結(jié)構(gòu)使其在油水混合液中可以擴(kuò)散到油水界面形成油水乳化液，在油滴周圍形成一層膜，避免脂肪的聚集，蛋白質(zhì)促使油和水形成乳化液，并保持乳化液穩(wěn)定的能力即為蛋白質(zhì)的乳化特性。由圖5可知，隨著超聲波功率的增加，KBP的乳化性和乳化穩(wěn)定性逐漸增加，但功率超過500 W時，乳化性和乳化穩(wěn)定性反而下降。這是因為，一方面，當(dāng)超聲波功率增大時，聲強(qiáng)增大，蛋白質(zhì)溶液受到的負(fù)壓也隨之增大，水分子間平均距離就會增大，超過極限距離后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，造成空穴，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)變得疏松，乳化能力及乳化穩(wěn)定性得到提高。當(dāng)功率繼續(xù)增大，蛋白質(zhì)變性增大，超聲波顯現(xiàn)出強(qiáng)烈的機(jī)械性斷鍵作用，不溶性蛋白質(zhì)含量增多，乳化性能隨之降低［21］。另一方面，蛋白質(zhì)的乳化性能與其表面疏水性存在一定關(guān)系，低功率超聲有利于蛋白分子疏水基團(tuán)的外露，使蛋白質(zhì)親水、疏水基團(tuán)增多，乳化能力增強(qiáng);但過高的功率又會使蛋白的表面疏水性顯著降低，乳化性能下降［22－23］。因此，超聲波功率的大小對KBP乳化性能改善至關(guān)重要。

圖5 超聲波功率對蕓豆蛋白乳化性的影響

2.6 超聲波處理對KBP吸油性的影響

蛋白質(zhì)的非極性區(qū)域和脂類的非極性脂肪族鏈間存在疏水作用，蛋白質(zhì)與甘油三酸酯形成脂－蛋白復(fù)合物，因而具有吸油性。由圖6可以看出，在0～200 W范圍內(nèi)，隨著超聲波功率的增加，KBP的吸油性增加。因為，超聲波作用使得蛋白分子原有構(gòu)象發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)變的疏松，將原來在分子內(nèi)部的一些非極性基團(tuán)暴露在分子表面，改善了蛋白分子的吸油性。但另一方面，超聲波功率繼續(xù)增大時，蛋白質(zhì)逐漸變性，不溶性蛋白增多，導(dǎo)致功率＞200 W時吸油性逐漸下降。

圖6 超聲波功率對蕓豆蛋白吸油性的影響

3 結(jié)論

超聲波對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及功能性質(zhì)的影響歸根結(jié)底是由于超聲波對其結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生了作用。通過對不同功率超聲波處理KBP后的紫外光譜和熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)，超聲波處理改變了KBP的空間結(jié)構(gòu)。蛋白空間結(jié)構(gòu)的變化引起了功能性質(zhì)的改變。表現(xiàn)在，KBP的溶解度隨著超聲波功率的提高而增加，當(dāng)超聲波功率分別為400 W和500 W時，KBP的起泡性能和乳化性能最高，超聲波功率為200 W時，KBP的吸油性最高。研究表明，通過選擇適宜的超聲波功率水平能夠改善蕓豆蛋白的理化和功能性質(zhì)。

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