蓖麻籽脂質(zhì)提取與甲酯化衍生優(yōu)化及其脂肪酸組成分析

樓喬明 楊文鴿 徐大倫 金 淼 吳東曉 鄭賢孟

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211)

蓖麻(Ricinus communis L.)俗稱大麻子、老麻子、草麻等，是大戟科一年生或多年生草本植物，是世界上十大油料作物之一，屬特殊工業(yè)油料作物［1］。目前，我國蓖麻籽產(chǎn)量居世界第二，僅次于印度。在世界能源日益匱乏的今天，蓖麻作為能源作物具有重要的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會意義，被稱為可再生的石油資源［2］。

蓖麻籽油是自然界中具有獨(dú)特性能的植物油，是蓖麻油酸唯一的工業(yè)來源，其除含有一般植物油脂肪酸分子中的烯鍵和酯基外，還含有一個羥基，賦予其獨(dú)特的性質(zhì)和用途［3－4］。目前，蓖麻籽脂肪酸的研究多集中于脂肪酸分析，以及產(chǎn)地和品系間的脂肪酸比較;但有關(guān)蓖麻籽脂肪酸前處理過程的研究較少［5－6］。在脂肪酸的分析過程中，脂質(zhì)提取和甲酯化衍生是其中最為關(guān)鍵的兩大步驟，直接影響脂肪酸的定性定量分析。因此本研究對蓖麻籽的脂質(zhì)提取和甲酯化衍生方法進(jìn)行優(yōu)化，并通過氣相色譜質(zhì)譜方法定性定量分析蓖麻籽的脂肪酸組成，旨為蓖麻籽脂質(zhì)前處理和脂肪酸分析提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蓖麻籽:青島市綠島大藥房。

1.2 儀器和設(shè)備

6890N型氣相色譜儀、5973型質(zhì)譜儀:美國Agilent公司;Laborota 4000 efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:德國海道爾夫公司;AB135－S型精密電子分析天平:瑞士梅特勒－托利多公司;Milli－Q Synthesis超純水系統(tǒng):美國Millipore公司。

1.3 試劑

37種脂肪酸甲酯混標(biāo)和蓖麻油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品:美國Sigma公司;甲醇、氯仿、二氯甲烷、正己烷:均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 脂質(zhì)提取

Folch 提取法［7］;Bligh － Dyer提取法［8］;二氯甲烷 － 甲醇(2∶1)提取法［9］;正己烷 － 異丙醇(3∶2)提取法［10］;甲基叔丁基醚提取法［11］;索氏抽提法［12］。

1.4.2 甲酯化衍生

BF3－甲醇衍生法［13］:取 10 mg脂質(zhì)樣品，加入1 mL乙醚－正己烷混合液(2∶1)，振蕩使樣品完全溶解，加入1 mL 1 mol/L KOH－甲醇溶液，充分振蕩后于60℃水浴加熱30 min，冷卻后加入5 mL 14%的BF3－甲醇溶液，再次于60℃水浴加熱30 min，冷卻后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

HCl－ 甲醇衍生法［14］:取 10 mg 脂質(zhì)樣品，加入1 mL 2 mol/L HCl－甲醇溶液，充分振蕩溶解后于60℃水浴甲酯化15 min，冷卻后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

H2SO4－甲醇衍生法［15］:取 10 mg脂質(zhì)樣品，加入1 mL 5%濃硫酸－甲醇溶液，充分振蕩溶解后于70℃水浴甲酯化60 min，冷卻后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

KOH－甲醇衍生法:取10 mg脂質(zhì)樣品，加入1 mL 1 mol/L KOH－甲醇溶液，充分振蕩溶解后于60℃水浴甲酯化30 min，冷卻后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

酸堿結(jié)合衍生法:取10 mg脂質(zhì)樣品，加入1 mL 1 mol/L KOH－甲醇溶液，充分振蕩溶解后于60℃水浴甲酯化15 min，冷卻后;加入1 mL 2 mol/L HCl－甲醇溶液再次于60℃水浴甲酯化15 min，冷卻后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

室溫快速衍生法［16］:取10 mg脂質(zhì)樣品，加入1 mL石油醚(30～60℃)與苯混合液(1∶1)，振蕩使樣品完全溶解，加入1 mL 1 mol/L的KOH－甲醇溶液，混勻后在室溫下振蕩2～5 min，加入1 mL飽和氧化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

1.4.3 色譜條件

HP－INNOWax石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，高純氦氣為載氣，采用恒壓模式，壓力 54 kPa，分流比10∶1。進(jìn)樣口溫度230℃，檢測器溫度250℃，柱溫以3℃/min由140℃升到230℃，并在230℃下保持10 min，整個分析過程為40 min。

1.4.4 質(zhì)譜條件

GC/MS接口溫度280℃，EI離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描周期2.84次/s，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～500 u。

1.5 統(tǒng)計分析

利用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因子方差分析法(ANOVA，Tukey檢驗(yàn))進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并采用Duncan＇s法進(jìn)行單因子多重比較分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻籽脂質(zhì)提取

通過7種方法對蓖麻籽的脂質(zhì)進(jìn)行提取，脂質(zhì)提取結(jié)果列于表1。從表1可知不同方法的蓖麻籽脂質(zhì)提取率介于43.64% ～58.73%，且不同方法的脂質(zhì)提取率具有顯著差異。Folch法作為脂質(zhì)提取的經(jīng)典方法，其蓖麻籽的脂質(zhì)提取率最高(58.73%);二氯甲烷－甲醇法次之(58.25%);而正己烷－異丙醇法和正己烷索氏抽提法的脂質(zhì)提取率較低，分別為48.57%和43.64%，遠(yuǎn)低于Folch法和二氯甲烷－甲醇法，具有顯著差異(P＜0.05);而同為索氏抽提法，乙醚作為抽提溶劑，其脂質(zhì)提取率顯著高于正己烷(P＜0.05)。綜合比較7種提取方法發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑對脂質(zhì)的溶解性是影響蓖麻籽脂質(zhì)提取率的重要因素;氯仿、二氯甲烷對蓖麻籽脂質(zhì)的溶解性較強(qiáng)，致使Folch法、Bligh－Dyer法和二氯甲烷－甲醇法對蓖麻籽脂質(zhì)有著較好的提取效果;而正己烷對蓖麻籽脂質(zhì)的溶解性較差，致使正己烷－異丙醇法和正己烷索氏抽提法的脂質(zhì)提取效果較弱［17－18］。二氯甲烷對蓖麻籽脂質(zhì)具有良好的溶解性，脂質(zhì)提取完全，提取效果與Folch法無顯著差異(P＞0.05)，可作為氯仿的有效替代溶劑，且其毒性遠(yuǎn)低于氯仿，能有效降低試劑的人體危害和環(huán)境污染，因此二氯甲烷－甲醇法是提取蓖麻籽脂質(zhì)的理想方法。

表1 不同方法的蓖麻籽脂質(zhì)提取率(n=3)

2.2 蓖麻籽脂質(zhì)甲酯化衍生

蓖麻籽脂質(zhì)經(jīng)二氯甲烷－甲醇法提取，采用不同甲酯化方法衍生，萃取定容后通過氣相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行峰面積和有效峰面積率分析，結(jié)果列于表2。從表2可知在6種甲酯化衍生方法中，H2SO4－甲醇法獲得的峰面積最大(2.85×106)，酸堿結(jié)合法(2.83×106)和 HCl－甲醇法(2.78 ×106)次之，室溫快速衍生法所獲峰面積最小(2.17×106)，表明H2SO4－甲醇法甲酯化衍生較為充分完全;而室溫快速衍生法雖具有衍生時間短和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，但其甲酯化衍生程度較低［19－21］。

根據(jù)李鳳娟等［5－6］研究，結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜分析共從蓖麻籽中鑒定出7種脂肪酸，并對這7種脂肪酸的有效峰面積和有效峰面積率進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)6種甲酯化衍生方法的有效峰面積率介于87.05% ～99.11%，且不同衍生方法存在顯著差異(P ＜0.05)［5－6］。室溫快速衍生法的有效峰面積率最高(99.11%)，KOH － 甲醇法(97.95%)和酸堿結(jié)合法(97.17%)次之，而H2SO4－甲醇法的有效峰面積最低，僅為87.05%。不同甲酯化衍生方法的有效峰面積率差異主要與衍生過程中脂肪酸不飽和雙鍵遷移、反式異構(gòu)化以及蓖麻油酸羥基脫水等副反應(yīng)有關(guān)，酸堿條件以及長時間加熱過程易使異構(gòu)化等副反應(yīng)發(fā)生，致使有效峰面積率降低［13，20－21］。

通過對6種甲酯化衍生方法比較可知:H2SO4－甲醇法對蓖麻籽脂質(zhì)衍生較為完全，但易使蓖麻籽脂肪酸發(fā)生異構(gòu)化等副反應(yīng)，降低目標(biāo)脂肪酸的有效峰面積率;室溫快速衍生法甲酯化條件溫和、反應(yīng)時間短、副反應(yīng)少以及目標(biāo)脂肪酸的有效峰面積率高，但其甲酯化衍生程度較低。綜合比較發(fā)現(xiàn)酸堿結(jié)合衍生法對蓖麻籽脂質(zhì)具有較好的甲酯化衍生效果以及較高的有效峰面積率，是一種理想的蓖麻籽脂質(zhì)甲酯化衍生方法。

表2 不同衍生方法的蓖麻籽脂肪酸峰面積(n=3)

2.3 蓖麻籽脂肪酸組成分析

蓖麻籽脂肪酸通過標(biāo)準(zhǔn)品對照和數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行定性分析，并按峰面積歸一法進(jìn)行定量，其總離子流色譜圖和分析鑒定結(jié)果分別見圖1和表3。從蓖麻籽脂質(zhì)中共鑒定出7種脂肪酸，主要為蓖麻油酸(12－OH C18∶1n－9)、亞油酸(C18∶2n－6)、油酸(C18∶1n －9)，少量棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)以及極少量亞麻酸(C18∶3n－3)和二十碳烯酸(C20∶1n －9)。

6種衍生方法所測的蓖麻油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化范圍為76.43% ～86.50%，其中室溫快速衍生法所測的蓖麻油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，高達(dá)86.50%;HCl－甲醇衍生法(85.00%)和酸堿結(jié)合衍生法(84.88%)次之;H2SO4－甲醇法所測最低，僅為76.43%，具有顯著差異(P＜0.05);亞油酸和油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化范圍分別為4.88% ～6.27%和2.70% ～4.18%。不同甲酯化衍生方法所測蓖麻籽脂肪酸含量的差異主要與衍生過程中不飽和脂肪酸的雙鍵遷移、反式異構(gòu)化以及羥基脫水形成共軛雙鍵等副反應(yīng)有著重要關(guān)系［20－22］;在 H2SO4、BF3以及長時間加熱過程易使脂肪酸發(fā)生異構(gòu)化等副反應(yīng)，致使蓖麻籽中的不飽和脂肪酸和蓖麻油酸的含量顯著降低，造成分析損失。室溫快速衍生法反應(yīng)溫度低、時間短，致使甲酯化過程副反應(yīng)少，所測蓖麻籽不飽和脂肪酸和蓖麻油酸相對含量高;但其衍生不完全，甲酯化程度較低。綜合比較分析酸堿結(jié)合衍生法甲酯化完全、副反應(yīng)少，能很好地反映蓖麻籽脂肪酸的真實(shí)組成，可作為一種理想的蓖麻籽脂質(zhì)甲酯化衍生方法。

圖1 蓖麻籽脂肪酸甲酯的GC/MS總離子流色譜圖

表3 不同甲酯化衍生方法的蓖麻籽脂肪酸組成(n=3)

3 結(jié)論

3.1 采用不同方法對蓖麻籽脂質(zhì)進(jìn)行提取，結(jié)果表明有機(jī)溶劑的溶解性對蓖麻籽脂質(zhì)的提取效果有著顯著影響。二氯甲烷對蓖麻籽脂質(zhì)具有較高的提取率，且其毒性遠(yuǎn)低于氯仿，是蓖麻籽脂質(zhì)提取的理想溶劑。

3.2 不同甲酯化方法對蓖麻籽脂質(zhì)的衍生效果有顯著差異。綜合比較6種甲酯化衍生方法表明酸堿結(jié)合甲酯化衍生方法具有甲酯化完全、副反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，是蓖麻籽脂質(zhì)甲酯化衍生的一種有效方法。

3.3 蓖麻籽脂肪酸以蓖麻酸(76.43%～86.50%)、亞油酸(4.88%～6.27%)和油酸(2.70%～4.18%)為主，并含有少量的棕櫚酸(1.00%～1.37%)、硬脂酸(0.90% ～1.27%)。不同甲酯化衍生方法對蓖麻籽脂肪酸組成分析有較大影響，同時綜合分析6種甲酯化衍生方法發(fā)現(xiàn)酸堿結(jié)合法能更好地反映蓖麻籽脂肪酸的真實(shí)組成。

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