通竅健步湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

王君勝，李中秋，高正偉

腦梗死是神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)病及常見(jiàn)病，具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了人民的健康。觀察通竅健步湯對(duì)急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積及血清過(guò)氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮等指標(biāo)的影響，本研究探討其腦保護(hù)作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 成年健康SD大鼠48只，體重220g～260g，清潔級(jí)，雌雄不限，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在通風(fēng)、濕度、溫度適宜的動(dòng)物室內(nèi)單籠飼養(yǎng)。通竅健步湯由我院藥劑科配制。依達(dá)拉奉注射液（江蘇先聲藥業(yè)集團(tuán)，每支15mg）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）試劑盒由南京建成生物工程公司購(gòu)進(jìn)；紅四氮唑（TTC）由上海生物工程公司購(gòu)進(jìn)。實(shí)驗(yàn)儀器由我院檢驗(yàn)科提供。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 造模方法 參照Z(yǔ)ea Longa線栓法［1］制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型。各組大鼠均缺血2h后，抽出尼龍線，恢復(fù)頸內(nèi)動(dòng)脈充盈，再灌注24h開始給予藥物干預(yù)，連續(xù)7d，第8天處死動(dòng)物。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，而后縫合傷口。模型成功的標(biāo)志［2］：以大鼠清醒左側(cè)肢體不能完全伸展，左側(cè)Horner征，爬行時(shí)向右側(cè)劃圈，神經(jīng)功能評(píng)分在1分～3分。假手術(shù)組除不插線外，其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)出血過(guò)多、死亡，以及術(shù)后評(píng)分為0分或4分的動(dòng)物棄去不用，另取動(dòng)物補(bǔ)充。

1．2．2 分組及給藥 將SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉組（每日給藥0．3mg／kg，經(jīng)尾靜脈注入）、通竅健步湯組，灌胃劑量根據(jù)臨床成人口服劑量換算成12g／（kg·d），將中藥水煎濃縮為3g／mL。每組動(dòng)物12只，假手術(shù)組和模型組分別給予等體積生理鹽水灌胃。各組均于造模成功后給藥，連續(xù)7d。第8天處死動(dòng)物，采集標(biāo)本檢測(cè)。

1．3 檢測(cè)指標(biāo)

1．3．1 腦梗死體積測(cè)定 將各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物，用10%水合氯醛（0．3mL／100g）麻醉，快速斷頭取腦，于－20℃冰箱中速凍20 min；將腦組織沿冠狀面間隔2mm，連續(xù)作7個(gè)冠狀腦切片，將腦片放入2%TTC磷酸鹽緩沖溶液中37℃避光水浴30min染色，數(shù)碼相機(jī)拍照，用圖片處理軟件（ADOBE，PHOTOSHOP CS3），計(jì)算腦梗死體積百分比（紅色為正常腦組織，白色為腦梗死組織）。

1．3．2 血清SOD、MDA、NO測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采腹主動(dòng)脈血3mL，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13．0軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2．1 通竅健步湯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響（見(jiàn)表1）

表1 各組腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積比較（±s）

表1 各組腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積比較（±s）

與模型組比較，1）P＜0．01

組別 n 腦梗死體積（mm3）假手術(shù)組12 0模型組 12 182．3±57．7依達(dá)拉奉組 12 133．5±34．8通竅健步湯組 12 125．8±34．11）

2．2 通竅健步湯對(duì)大鼠血清SOD、MDA、NO含量的影響（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠血清SOD、MDA、NO含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清SOD、MDA、NO含量比較（±s）

與模型組比較，1）P＜0．01

組別 n SOD U／mL MDA nmol／mL NO μmol／mL假手術(shù)組12 82．12±10．81 3．16±0．82 43．63±14．21模型組 12 35．23±5．46 4．86±0．93 118．47±23．26依達(dá)拉奉組 12 78．44±8．851） 3．75±0．781） 75．72±19．471）通竅健步湯組 12 72．26±9．541） 3．53±0．711） 66．24±16．451）

3 討 論

急性腦缺血后自由基清除酶活性降低，自由基產(chǎn)生急劇增多。氧自由基大量生成后，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解、核酸斷裂、線粒體變性、崩解，神經(jīng)細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜、微血管系統(tǒng)受到破壞，從而產(chǎn)生一系列臨床癥狀。丙二醛是氧自由基引發(fā)的生物膜不飽和脂肪酸過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量反映體內(nèi)氧自由基的生產(chǎn)水平及對(duì)組織的損傷程度。過(guò)氧化物歧化酶是體內(nèi)產(chǎn)生的一種重要的抗氧化酶，常作為清除氧自由基能力的主要指標(biāo)。腦缺血早期數(shù)分鐘內(nèi)產(chǎn)生的一氧化氮對(duì)神經(jīng)保護(hù)是有利的，但數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)產(chǎn)生的一氧化氮?jiǎng)t有明顯的神經(jīng)毒性作用［3－5］。

依達(dá)拉奉是一種強(qiáng)效的自由基清除劑及抗氧化劑［6］，具有捕獲羥自由基活性，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、抑制腦細(xì)胞過(guò)氧化作用，能夠減輕腦水腫和腦組織損傷。通竅健步湯前期臨床觀察研究表明，能減輕炎癥反應(yīng)，清除氧自由基，提高機(jī)體的抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)研究表明，通竅健步湯能夠顯著減輕大鼠腦梗死體積（P＜0．01），顯著提高大鼠血清SOD活性，降低 MDA及NO含量（P＜0．01），其作用效果與依達(dá)拉奉相似（P＞0．05）。通竅健步湯可能是通過(guò)清除氧自由基達(dá)到保護(hù)腦缺血再灌注損傷的作用。

［1］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20（1）：84．

［2］ Berderson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al．Rat middle cerebral artery occlusion：Evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］．Stroke，1986，17 （3）：472－476．

［3］ Ezqur ME，Valdez SR，Seltzer AM．Inflammatory responses of thesubstantia niagara after acute hypoxia in neonatal rats［J］．Exp Neuol，2006，97 （2）：39－45．

［4］ 張敬偉．NO、SOD與缺血性腦血管病的關(guān)系［J］．中國(guó)誤診學(xué)雜志，2005，5（5）：900．

［5］ 鄭曉影，趙淑敏，陳萌．局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦SOD和MDA的變化［J］．承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，26（1）：12－14．

［6］ 李檢生．新型自由基清除劑依達(dá)拉奉的腦保護(hù)作用［J］．國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2006，33（2）：125．