原花青素聯(lián)合缺血后處理對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

許素銘，宋 明，張 旻，王耀琴，弓 韜，覃秀桃

近年來(lái)，隨著溶栓治療和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的廣泛應(yīng)用，研究和探討心臟缺血再灌注損傷的機(jī)制和減輕心肌損傷的有效措施已成為眾多專家學(xué)者研究的熱點(diǎn)。有研究報(bào)道［1，2］，不僅缺血預(yù)處理和缺血后處理可以減輕再灌注損傷，而且在缺血前后給予藥物干預(yù)可減輕其損傷。原花青素（procyanidine，PC）［3］主要通過抗氧化作用，在防治心血管疾病、改善人體微循環(huán)等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。原花青素能通過預(yù)防高脂狀態(tài)下大鼠胸主動(dòng)脈壁過氧化物酶增殖體激活受體γ（peroxisome proliferator－activated receptorγ，PPARγ）mRNA 表達(dá)下調(diào)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）的激活，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的形成［4］。本實(shí)驗(yàn)通過原花青素與缺血后處理聯(lián)合干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞，觀察其凋亡率和磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（P－p38MAPK）表達(dá)的影響，試圖證明該聯(lián)合應(yīng)用能加強(qiáng)對(duì)心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 試劑 H9C2細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心；核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；原花青素（含量95%）購(gòu)于上?？稻呕び邢薰?；AO、EB購(gòu)于Sigma公司；β－actin多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L）二抗購(gòu)于Santa Cruz公司；兔抗大鼠磷酸化p38多克隆抗體購(gòu)于Cell signal；其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 模擬缺血／再灌注損傷模型的建立 參照姚震等［5］方法配制。將模擬缺血液充入氮?dú)猓兌?9%）飽和15min后置換正常培養(yǎng)溶液。然后，放入自制密封盒內(nèi)，充氮?dú)?0min后密封，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即為缺血。用模擬復(fù)血液置換缺血液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即為復(fù)血。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)分組 培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞分為4個(gè)組。C組：用復(fù)血培養(yǎng)基培養(yǎng)75min；I／R組：先缺血40min，再?gòu)?fù)血5 min；缺血后處理（IPO）組：缺血40min，然后復(fù)血／缺血5min，交替循環(huán)3次，再?gòu)?fù)血5min；PC＋I(xiàn)PO組：先缺血40min，再加入終濃度為100μmol／L的PC，37℃培養(yǎng)20min，然后進(jìn)行IPO處理。

1．3 AO－EB雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 干預(yù)結(jié)束后，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為107個(gè)／mL；取細(xì)胞懸液25μL，滴加4 μL AO－EB染液于載玻片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。

1．4 Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞P－p38MAPK蛋白表達(dá)用細(xì)胞裂解液提取心肌細(xì)胞總蛋白，10%SDS－PAGE凝膠電泳分離目的蛋白后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入兔抗大鼠磷酸化p38多克隆抗體（1∶400）一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入山羊抗兔IgG HRP（1∶1 000）二抗，37℃孵育1．5h，并以兔抗大鼠β－actin（1∶500）多克隆抗體同上操作，作為上樣對(duì)照；TBST洗膜后，ECL顯色；使用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描和密度分析，計(jì)算目的條帶的平均光密度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2．1 各組H9C2心肌細(xì)胞凋亡情況 對(duì)0、12h、24h各時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，I／R組凋亡細(xì)胞增多，提示缺血再灌注造成了心肌細(xì)胞損傷。經(jīng)IPO干預(yù)后，凋亡細(xì)胞減少，與I／R組比較其凋亡率顯著降低（P＜0．01）。說(shuō)明IPO可通過抗凋亡作用減少再灌注損傷。PC和IPO聯(lián)合應(yīng)用后，其凋亡率均降低，并且在1 2h時(shí)，PC＋I(xiàn)PO組其凋亡率顯著低于IPO組（P＜0．05）。PC和IPO聯(lián)合干預(yù)可加強(qiáng)這一保護(hù)作用。詳見圖1。

圖1 各組0h、12h、24h、48h細(xì)胞平均凋亡率

2．2 各級(jí)H9C2心肌細(xì)胞P－p38MAPK表達(dá)情況 在12h時(shí)，I／R組P－p38MAPK的表達(dá)高于C組（P＜0．01），再灌注可以激活P38磷酸化；當(dāng)IPO單獨(dú)和聯(lián)合PC干預(yù)后P－p38 MAPK的表達(dá)均顯著低于I／R組（P＜0．01），并且PC＋I(xiàn)PO組低于IPO組（P＜0．05）。IPO單獨(dú)和聯(lián)合PC干預(yù)可降低P－p38 MAPK的表達(dá)，并且PC聯(lián)合IPO比單純IPO明顯。詳見圖2。

圖2 12h時(shí)磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)變化

3 討 論

缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）作為一種威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，引起了人們的廣泛關(guān)注。近年來(lái)，隨著溶栓療法、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等治療方法的廣泛應(yīng)用，在盡早恢復(fù)血流供應(yīng)方面取得了很大的進(jìn)步和改善，但同時(shí)也會(huì)加重心肌原有損害即所謂的缺血／再灌注損傷。有研究表明，缺血后處理能有效減輕再灌注損傷，其機(jī)制與氧自由基產(chǎn)生減少有關(guān)［6，7］。

絲裂原活化蛋白激酶家族（mitogen－activated protein kinase，MAPK）是一類廣泛存在的絲／蘇氨酸蛋白激酶，可被缺血、低氧、激素、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子等刺激因素所激活，將信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)致細(xì)胞核來(lái)調(diào)控特定基因表達(dá)。其中，p38 MAPK作為MAPKs家族的主要成員之一，被稱為MAPK的應(yīng)激激活通路。心肌的缺血再灌注可通過磷酸化激活p38 MAPK，而被激活的p38MAPK通過對(duì)Bcl－2／Bax線粒體途徑和腫瘤壞死因子（TNFα）細(xì)胞受體途徑的影響促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。缺血再灌注損傷是常見的復(fù)雜病理生理過程，過多的自由基可造成心肌損傷，而抑制氧自由基的產(chǎn)生可減輕這種損傷［9］。研究發(fā)現(xiàn)［10］，原花青素通過抑制氧自由基的生成，保護(hù)再灌注對(duì)心臟造成的損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)在缺血后處理的基礎(chǔ)上聯(lián)合了原花青素進(jìn)行干預(yù)，從細(xì)胞平均壞死率和P－p38MAPK的表達(dá)入手，探討了IPO單獨(dú)和聯(lián)合PC干預(yù)對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PC＋I(xiàn)PO組和IPO組均可減少心肌細(xì)胞凋亡，P－p38MAPK的表達(dá)也顯著下降，并且PC＋I(xiàn)PO組作用更為明顯。IPO單獨(dú)或聯(lián)合PC干預(yù)可抑制p38MAPK，減輕細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并且PC和IPO的聯(lián)合干預(yù)能增強(qiáng)這一作用。分析推測(cè)PC和IPO的聯(lián)合干預(yù)之所以能增強(qiáng)這一作用可能與原花青素清除氧自由基作用有關(guān)。因此，這也將成為下一步的研究方向。

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