生地注射液抗凝血酶所致星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的實驗研究

周 霞，王 左，李文濤 ，魏江磊

自發(fā)性腦出血相關(guān)病理研究資料表明，腦出血后局部增加的凝血酶是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要因素［1］。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的內(nèi)科保守治療和外科手術(shù)均不能有效去除或逆轉(zhuǎn)凝血酶的神經(jīng)毒性作用。生地注射液有神經(jīng)元保護(hù)作用［2，3］。為了進(jìn)一步觀察生地注射液的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，選擇另外一種神經(jīng)細(xì)胞——星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，以觀察生地注射液對凝血酶所致星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 出生24hSD大鼠，雌雄不分，山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供；凝血酶（1 000U／瓶，Sigma生產(chǎn)）；杜拜克最底必須培養(yǎng)基（DMEM，13．5g／包，Gibco生產(chǎn)）；胎牛血清（FBS）、小牛血清（CS，杭州四季青生物制品公司生產(chǎn)，用前滅活）；多聚賴氨酸（Sigma生產(chǎn)）；生地注射液（上海曙光醫(yī)院藥劑科制備）；TUNEL試劑盒（Onco－gene生產(chǎn)）；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，Becton Dickinson生產(chǎn)）；圖 像分析系統(tǒng) （QSOOiW，LEICA生產(chǎn)）。

1．2 實驗方法 星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、純化及鑒定參照文獻(xiàn)方法［4］。將新生SD大鼠兩側(cè)頸動脈切斷放血后投入75% 酒精中溺斃，無菌條件下取出整個大腦皮層。解剖顯微鏡下剝離腦膜、除去海馬，置入盛有D－Hanks液的離心管中。用直徑0．5mm的吸管反復(fù)多次吹打，直至將整個大腦皮質(zhì)完全吹打成單細(xì)胞混懸液。1000r／min離心5min～10min，棄上清液。用80%DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計數(shù)后接種于事先涂有0．05g／L多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中。3d后換培養(yǎng)液，以后每隔2日換細(xì)胞培養(yǎng)液1次。待細(xì)胞鋪滿瓶底，用0．25%的胰酶消化，傳代。3代后用抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體標(biāo)記，DAB染色證實，得到純度在95%左右的星形膠質(zhì)細(xì)胞。分組及處理。將經(jīng)純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞消化，離心，懸浮，計數(shù)后用于實驗。其中丫啶橙染色時細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，每張蓋玻片接種細(xì)胞1×104個；亞二倍體細(xì)胞測定時，細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿接種細(xì)胞約1×106個；TUNEL法檢測時，細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿接種細(xì)胞約1×106個。培養(yǎng)48h后分組，正常對照組：用含90%的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；凝血酶組：用100U／mL凝血酶＋90%DMEM的培養(yǎng)液培養(yǎng)；生地注射液組：用含4%的生地注射液＋100U／mL凝血酶＋90%DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。丫啶橙染色：24h后吸棄培液，每只培養(yǎng)皿加入5μg／mLAO1mL，10min后在熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片。

亞二倍體細(xì)胞比例測定。經(jīng)過處理的各組細(xì)胞，移去培養(yǎng)液，消化細(xì)胞后加血清終止反應(yīng)，反復(fù)沖洗、離心后棄上清，加PI1mL染色，用孔徑60μm的尼龍網(wǎng)過濾后，存放在4℃冰箱內(nèi)，20min后上機(jī)檢測G／G期之前的亞二倍體峰，計算凋亡百分率。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）：制備單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞均勻貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，然后按照TUNEL試劑盒說明書操作。每組選取3張玻片，每片任取3個視野拍攝照片，采用LEICAQ500IW圖像分析系統(tǒng)分析陽性細(xì)胞所占面積比。并觀察拍照，每組選擇9個視野，進(jìn)行統(tǒng)計，比較各組間差異。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17．0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2．1 丫啶橙染色 在熒光顯微鏡下觀察到，經(jīng)丫啶橙染色后，正常細(xì)胞為黃色或黃綠色均勻熒光，凋亡細(xì)胞內(nèi)可見致密濃染的黃綠色熒光，甚至為黃綠色碎片。正常對照組中凋亡細(xì)胞數(shù)很少，凝血酶損傷組具有凋亡特征的細(xì)胞數(shù)較多，生地注射液組和凝血酶組相比凋亡細(xì)胞數(shù)有明顯減少。

2．2 亞二倍體細(xì)胞測定 和正常對照組相比，凝血酶組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0．05），生地注射液組較凝血酶組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0．05）。詳見表1。

表1 生地注射液對凝血酶所致星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表1 生地注射液對凝血酶所致星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響（±s）

與正常對照組比較，1）P＜0．05；與凝血酶組相比，2）P＜0．05

組別 n 凋亡率（%）正常對照組6 1．02±0．38凝血酶組 6 14．09±0．551）生地注射液組 6 4．14±0．622）

2．3 TUNEL 凝血酶組TUNEL染色陽性的細(xì)胞數(shù)較正常對照組顯著升高（P＜0．05）；生地注射液組TUNEL染色陽性的細(xì)胞數(shù)較凝血酶組顯著降低（P＜0．05）。詳見表2。

表2 生地注射液對凝血酶所致星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL染色）（±s）

表2 生地注射液對凝血酶所致星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL染色）（±s）

與凝血酶組相比，1）P＜0．05

組別 n TUNEL染色陽性細(xì)胞面積比（%）正常對照組 9 5．48±2．331）凝血酶組 9 18．13±8．69生地注射液組 9 12．25±5．101）

3 討 論

《素問·陰陽應(yīng)象大論》說：年四十而陰氣自半也，起居衰矣。即：不知養(yǎng)身之人，年到四十，腎中陰精已經(jīng)衰減一半了，人也就開始衰老?！稏|垣十書·溯洄集·中風(fēng)辨》云：“中風(fēng)者，非外來風(fēng)邪，乃本氣自病也，凡人年逾四旬，氣衰之際，或因憂喜憤怒傷其氣者多有此疾”。《臨證指南醫(yī)案·中風(fēng)》篇也指出：“精血衰耗，水不涵木……肝陽偏亢，內(nèi)風(fēng)時起”。說明歷代中醫(yī)名家對卒中的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識趨于一致，即陰虛為本，陽亢為標(biāo)，其他因素為誘發(fā)因素。當(dāng)今人的生活節(jié)奏加快，生活壓力增大，憂思過度，暗耗心血。中醫(yī)又認(rèn)為：久病者，必耗傷氣陰。因此長年高血壓病、糖尿病、高血脂患者，更加重氣陰虧耗。因此，上海市名老中醫(yī)王左教授認(rèn)為，腦出血的基本病因在于陰虛為本，陰不制陽，肝陽化火灼傷脈絡(luò)而出血。中藥生地具有養(yǎng)陰生津、涼血止血的功效。既養(yǎng)陰，又止血，既治標(biāo)，又治本，尤適用于腦出血的治療。傳統(tǒng)煎劑既費時，又不可控制質(zhì)量，保證療效，不適應(yīng)于腦卒中的救治。因此研制成生地注射液，進(jìn)行了一系列的研究觀察，取得了初步成效［5－8］。

研究表明［9－11］，腦出血后除血腫的占位效應(yīng)外，凝血酶在病理過程中占有重要地位，主要表現(xiàn)為降低腦血流量，破壞血腦屏障，引起腦組織水和離子含量變化，直接損傷腦細(xì)胞，其中凋亡是凝血酶導(dǎo)致細(xì)胞死亡的重要方面。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞的重要類別。因此，應(yīng)用凝血酶作用于體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，使之造成凋亡，以觀察中藥對腦出血后這一環(huán)節(jié)的作用。用流式細(xì)胞儀分析亞二倍體細(xì)胞比例，以反映群體細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的比例。TUNEL通過標(biāo)記凋亡細(xì)胞DNA斷端3’－羥基末端，可以反映細(xì)胞凋亡的典型生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，特異性較高，是分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)結(jié)合的研究細(xì)胞凋亡的方法。結(jié)合圖像分析，也可定量比較。因此應(yīng)用方法結(jié)合分析，可從整體和個體、定性和定量方面反映細(xì)胞凋亡情況，可信度高。在本實驗中，與正常對照組相比，凝血酶組的細(xì)胞均有明顯的凋亡。生地注射液組盡管細(xì)胞凋亡仍高于正常對照組，但和凝血酶組相比有顯著改善。本實驗表明，生地注射液有抗凝血酶所致星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用，其作用環(huán)節(jié)尚有待進(jìn)一步深入研究。

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