糖尿病腦梗死大鼠在不同時間窗溶栓后MMP－9的表達(dá)變化

張 勇，牛小媛

目前急性缺血性腦血管病超早期（≤4．5h）最合理、有效的治療手段是溶栓。經(jīng)循證醫(yī)學(xué)證實，重組組織型纖溶酶原激活物（rt－PA）是唯一有效的溶栓藥物，臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用rt－PA溶栓后出血性轉(zhuǎn)化（hemorrhagic transformation，HT）率較急性腦梗死后自發(fā)出血性轉(zhuǎn)化率提高2倍～3倍［1－3］，因而限制了其應(yīng)用。已有研究表明，基底層結(jié)構(gòu)的降解與腦組織缺血再灌后出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生有關(guān)，基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）可以降解基底層［4］，腦組織缺血再灌后即激活 MMP－9的表達(dá)，而糖尿病合并腦梗死腦組織缺血再灌后MMP－9的表達(dá)較單純腦梗死更為顯著。故本試驗建立糖尿病大鼠腦梗死模型，研究在不同時間窗使用rt－PA溶栓治療后的療效，以及探討 MMP－9的表達(dá)上調(diào)與出血性轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與分組 健康成年雄性 Wistar大鼠120只，體重200g～250g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分為單純腦梗死（CI）組、糖尿?。―M）合并腦梗死組、假手術(shù)組，各組再分為2h、4h亞組，除假手術(shù)組每組18只外，余每組21只。隨機(jī)選取6只行腦組織含水量計算，6只行伊文思藍(lán)（EB）測定，6只行免疫組織化學(xué)法測定MMP－9表達(dá)，多余只數(shù)同時成模后備用。

1．2 方法

1．2．1 糖尿病腦梗死大鼠模型建立 大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)5d～7d，再給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)5周，實驗前將STZ溶解于pH 4．3的0．1mmol／L檸檬酸緩沖液內(nèi)，按40mg／kg腹腔注射，注射后間隔1d，采大鼠尾靜脈血測空腹血糖，以＞16．7mmol／L為判定標(biāo)準(zhǔn)，之后將成模大鼠繼續(xù)高糖高脂飲食喂養(yǎng)1月。實驗時，以供血大鼠股靜脈抽取血液即刻注入硬膜外麻醉導(dǎo)管中，室溫下留置2h，再置于4℃冰箱冷藏22h，將其切成長約10cm的片段，用注射器抽出管內(nèi)栓子移入另一兩端連接充滿生理鹽水注射器的導(dǎo)管中，來回晃動洗滌紅細(xì)胞約5min，之后放入生理鹽水待用。以10%水合氯醛將大鼠麻醉后做頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總（CCA）、頸內(nèi)（ICA）、頸外動脈（ECA），結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端，以動脈夾在頸總動脈分叉處夾閉頸總動脈，使用1 mL注射器吸入約8個栓子，通過5號針頭將血栓由頸外動脈注入，同時開放動脈夾，使栓子隨血流進(jìn)入大腦中動脈，再結(jié)扎頸外動脈近心端，縫合切口，成模。根據(jù)Longa－bederson評分法將＞0分且＜5分者入組。

1．2．2 給藥溶栓 實驗組將rt－PA按10mg／kg以等量生理鹽水配置，選股靜脈快速推注1／3，其余在15min內(nèi)推注完畢，假手術(shù)組給予等量生理鹽水。

1．2．3 腦組織含水量測定 采用干濕質(zhì)量法，各組大鼠在溶栓24h后隨機(jī)選取6只，分別斷頭取腦，切除嗅球、小腦和腦干，沿大腦中線切開，取右側(cè)大腦半球組織標(biāo)本，迅速在分析天平上稱取濕質(zhì)量，然后將標(biāo)本放置100℃烤箱內(nèi)烘24h，再分別稱其干重。以（濕質(zhì)量—干質(zhì)量）／濕質(zhì)量的百分比作為衡量腦含水量的指標(biāo)。

1．2．4 腦組織中EB含量測定 各組大鼠在溶栓24h后隨機(jī)選取6只，在處死前2h經(jīng)尾靜脈注射2%EB生理鹽水2ml／kg，2h后以10%的水合氯醛過量麻醉大鼠，開胸暴露心臟，取右側(cè)半球測定重量，再投入含有4mL甲酰胺的試管中，置于37℃恒溫水浴箱48h，然后離心（3 000r／min）10min，取上清液，在分光光度儀620nm波長下測量吸光度值，以蒸餾水作空白比色，計算出EB的含量。

1．2．5 切片標(biāo)本制備與免疫組織化學(xué)檢測 各組大鼠在溶栓24h后隨機(jī)選取6只，斷頭取腦，標(biāo)本固定、脫水、石蠟包埋，冠狀切片厚度5μm。采用免疫組織化學(xué)法檢測MMP－9的陽性表達(dá)，光鏡下免疫陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色。陰性對照切片不加一抗，以0．01mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）代替，余步驟相同。每只大鼠取相同部位的切片各3張，每張在高倍鏡（10×40）下隨機(jī)選取缺血區(qū)內(nèi)5個非重疊視野。觀察測量陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS13．0分析，定量資料組內(nèi)差異以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個樣本資料比較方差齊者采用方差分析，方差不齊者采用Kruskal－Wallis檢驗，多個樣本間兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠腦組織含水量比較DM＋CI4h組腦組織含水量顯著高于CI4h組和假手術(shù)組（P＜0．01）。詳見表1。

表1 各組大鼠腦組織含水量比較（±s） %

表1 各組大鼠腦組織含水量比較（±s） %

與假手術(shù)組同期比較，1）P＜0．01；與DM＋CI 2h比較，2）P＜0．01；與CI 4h比較，3）P＜0．01

組別2h 4h CI組 78．91±0．581）2）3） 80．87±0．451）DM＋CI組 80．84±0．571） 84．37±0．941）2）3）假手術(shù)組 76．87±0．20 76．89±0．29

2．2 各組大鼠腦組織中EB含量 伊文思藍(lán)法測定血腦屏障通透性顯示，DM＋CI組與單純CI組血腦屏障的通透性均增加，通過血腦屏障的EB含量升高，與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），DM＋CI 4h組與CI 4h組相比，EB含量顯著升高（P＜0．01）。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織中EB含量比較（±s） %

表2 各組大鼠腦組織中EB含量比較（±s） %

與假手術(shù)組同期比較，1）P＜0．01；與DM＋CI組比較，2）P＜0．01；與CI組4h比較，3）P＜0．01

組別2h 4h CI組 4．17±0．131）2）3） 4．60±0．361）DM＋CI組 5．03±0．161） 7．98±0．761）2）3）假手術(shù)組 2．22±0．30 2．10±0．21

2．3 各組不同溶栓時間點缺血區(qū) MMP－9表達(dá) DM＋CI 4h組 MMP－9表達(dá)較單純CI 4h組升高（P＜0．01）。詳見表3。

表3 各組大鼠MMP－9表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s） %

表3 各組大鼠MMP－9表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s） %

與假手術(shù)組同期比較，1）P＜0．01；與DM＋CI 2h比較，2）P＜0．01；與CI組比較，3）P＜0．01

組別2h 4h CI組 6．17±0．751）2） 12．50±1．051）DM＋CI組 12．83±0．751） 21．00±0．631）2）3）假手術(shù)組 1．50±0．55 1．33±0．52

3 討 論

腦梗死溶栓后發(fā)生HT的重要原因，是由于血腦屏障（BBB）的結(jié)構(gòu)與功能破壞使其通透性增高。維持BBB完整的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是血管基膜與內(nèi)皮細(xì)胞［5］，其中血管基膜的主要成分為細(xì)胞外基質(zhì)（基底層），基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族可以降解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)的成分，溶栓治療前血液中MMP－9水平可以預(yù)測溶栓后出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生［6，7］。MMP－9以無活性形式（分子質(zhì)量 92 000）分泌，在正常狀態(tài)下微量存在，多種細(xì)胞參與了其合成（中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等），腦缺血損傷后受損區(qū)細(xì)胞釋放出黏附分子及細(xì)胞因子，使循環(huán)中的白細(xì)胞到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)并聚集在腦缺血損傷區(qū)，再與其他因子通過一系列級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)誘導(dǎo)MMP－9產(chǎn)生并將其激活（分子質(zhì)量83 000），激活后的 MMP－9行使其蛋白水解酶的作用，降解基膜，破壞BBB，增加了血管壁的通透性，HT形成［8］。另外，血中纖溶酶也可將MMP－9活化，而纖溶酶原活性又可被rt－PA誘導(dǎo)，因此在使用rt－PA溶栓時，MMP－9活化加劇HT。

糖尿病是腦梗死的一個重要的、獨立的危險因素，有糖尿病基礎(chǔ)病合并腦梗死的患者病情較重，易進(jìn)展，且有相應(yīng)的不同程度的腦血管基礎(chǔ)病變，其主要病理改變是動脈粥樣硬化（AS）。已有研究證實在AS斑塊內(nèi)，MMP－9的表達(dá)及活性顯著增高［9］，其在AS斑塊中能降解纖維帽及基膜的膠原等基質(zhì)成分，可使纖維帽變薄、斑塊破裂，加之MMP－9降解基膜主要成分Ⅳ型膠原使內(nèi)膜損傷，上述病理變化長期存在，故糖尿病腦梗死患者比單純腦梗死患者在溶栓時出血性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險會更高。本研究通過對不同時間窗使用rt－PA溶栓治療后的療效，以及MMP－9的表達(dá)上調(diào)與出血性轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系探討，認(rèn)為在溶栓過程中，MMP－9的高度表達(dá)使得本來就已經(jīng)很脆弱的血腦屏障遭到了更為徹底的破壞，從而增加了溶栓治療后出血性轉(zhuǎn)化風(fēng)險。這說明糖尿病腦梗死患者的溶栓時間窗很短，且在溶栓治療時應(yīng)該更為嚴(yán)格把握適應(yīng)證與禁忌證。目前，國內(nèi)外已在臨床使用依達(dá)拉奉、米諾環(huán)素等抑制MMP－9表達(dá)上調(diào)，從而降低出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生率，使許多糖尿病腦梗死患者從溶栓治療中獲益。未來，可能通過提前對血清MMP－9水平的預(yù)調(diào)控，達(dá)到延長溶栓治療時間窗的目的。MMP－9與溶栓后出血性轉(zhuǎn)化發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系尚需進(jìn)一步研究。

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