紅藤消炎灌腸液微生物限度檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)

● 王偉東

紅藤消炎灌腸液具清熱解毒，活血化瘀功效，臨床用于附件炎、盆腔炎。其成分為大血藤、野菊花、蒲公英、地丁、敗醬草、三棱、莪術(shù)(醋制)、桃仁、延胡索(醋制)、香附(醋制)、木香等11味中藥，因處方中多味藥有抗菌、消炎的作用，對(duì)試驗(yàn)菌采用常規(guī)方法做微生物限度檢查時(shí)，對(duì)陽(yáng)性試驗(yàn)菌干擾，陽(yáng)性試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到藥典要求的不低于70%。我們采用薄膜過(guò)濾法［1］，按中國(guó)藥典2010年版二部相關(guān)規(guī)定［2］進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，該法省時(shí)、易操作，適用于紅藤消炎灌腸液微生物限度檢查。

1 材料

1.1 儀器 凈化工作臺(tái)(szk－202安徽省蚌埠凈化設(shè)備有限公司)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(PYX_DHS－40*50上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、立式滅菌器(3260J山東新華醫(yī)療器械有限公司)、薄膜過(guò)濾器(杭州泰林生物技術(shù)有限公司)、集菌儀(H601杭州高得醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁氏液體培養(yǎng)基、改良馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基，均由北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 稀釋劑 氯化鈉－蛋白胨緩沖液，北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.4 菌種 大腸埃希菌［CMCC(B)44102］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，所有菌種均為第4代。

1.5 樣品 紅藤消炎灌腸液(500ml/瓶)，黃石市中醫(yī)院制劑室提供。

2 方法

2.1 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)檢查方法的驗(yàn)證

2.1.1 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24h，取上述新鮮培養(yǎng)物1ml，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，稀釋至活菌數(shù)50～100cfu·ml－1，備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁氏液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)18～24h，取上述新鮮培養(yǎng)物 1ml，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，稀釋至活菌數(shù)50～100cfu·ml－1，備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁氏瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)1周，加5ml的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，洗下霉菌孢子，吸出菌液，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，取上述新鮮培養(yǎng)物1ml，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，稀釋至活菌數(shù)50 ～100cfu·ml－1，備用。

2.1.2 供試液制備 吸取樣品10ml至有無(wú)菌玻璃珠的250ml三角燒瓶中，加90ml無(wú)菌的稀釋液，混勻，使成1∶10的供試液。取上述供試液10ml(相當(dāng)于樣品1ml)，加入100ml無(wú)菌稀釋液中，混勻，過(guò)濾，接著用200ml的稀釋劑沖洗，消除抑菌成分后，取出濾膜，菌面朝上，貼于規(guī)定的瓊脂平板上培養(yǎng)。

2.1.3 回收率測(cè)定

(1)試驗(yàn)組:分別取1∶10的供試液10ml(相當(dāng)于樣品1ml)，各加入100ml無(wú)菌稀釋液中，混勻，過(guò)濾，接著用400ml的稀釋劑沖洗，預(yù)留100ml稀釋劑各加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1ml(50～100cfu·ml－1)，按薄膜過(guò)濾法，取出濾膜，菌面朝上，貼于規(guī)定的瓊脂平板上，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h，逐目觀察結(jié)果。

(2)菌液組:除不加供試液外，其余操作同試驗(yàn)組。

(3)供試品對(duì)照組:除不加菌懸液外，其余操作同試驗(yàn)組。

(4)稀釋劑對(duì)照組:用稀釋液取代供試液，其余操作同試驗(yàn)組。

2.1.4 回收率計(jì)算 驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。

(1)試驗(yàn)組的菌回收率=

(2)稀釋劑對(duì)照組的菌回收率=

2.2 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.2.1 試驗(yàn)組 分別取1∶10的供試液10ml(相當(dāng)于樣品1ml)，各加入100ml無(wú)菌稀釋液中，混勻，過(guò)濾，接著用400ml的稀釋劑沖洗，預(yù)留100ml稀釋劑，分別加入金黃色葡萄球菌液1ml(50～100cfu·ml－1)、銅綠假單胞菌液1ml(50～100cfu·ml－1)，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上，分別貼于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24h。

2.2.2 陰性對(duì)照組:用稀釋劑10ml，替代供試液及驗(yàn)證菌液，按試驗(yàn)組進(jìn)行檢查和培養(yǎng)。

2.2.3 陽(yáng)性對(duì)照組:除不加供試液外，其余操作同試驗(yàn)組。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法的驗(yàn)證結(jié)果 回收率見(jiàn)表1，該試驗(yàn)對(duì)5種菌種的回收率均高于70%。

表1 薄膜過(guò)濾法菌落計(jì)數(shù)及回收率測(cè)定

3.2 控制菌檢查方法的驗(yàn)證結(jié)果 試驗(yàn)組檢出金黃色葡萄球、銅綠假單胞菌;陽(yáng)性對(duì)照組檢出金黃色葡萄球、銅綠假單胞菌;陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)。該方法能檢出金黃色葡萄球、銅綠假單胞菌，適合于該制劑的控制菌檢查。

4 討論

藥品的微生物限度檢查結(jié)果受許多因素的影響，在進(jìn)行微生物檢測(cè)時(shí)，只有在該檢測(cè)條件下的樣品濃度不足以抑制污染微生物的生長(zhǎng)，才能使供試品中污染的微生物得以真實(shí)反映。因此，藥品的微生物限度檢查應(yīng)通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)證明所采用的方法是適宜的，方可使用［3］。中藥制劑多為含有多種成分的復(fù)方制劑，同時(shí)生產(chǎn)中使用含抑菌作用的輔料以及加入抑菌劑或防腐劑等原因，影響微生物檢查結(jié)果的因素更多，必須采取合適的試驗(yàn)方法去除制劑的抑菌作用，才能真實(shí)反映制劑受污染的程度［4］。

通常，對(duì)無(wú)抑菌作用的制劑可用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查，對(duì)抑菌作用較弱的制劑可通過(guò)稀釋培養(yǎng)基來(lái)消除其抑菌作用。本文作者實(shí)際工作中對(duì)紅藤消炎灌腸液進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，發(fā)現(xiàn)該制劑具有很強(qiáng)的抑菌活性，不能直接采用常規(guī)法或稀釋培養(yǎng)基法。本文采用薄膜過(guò)濾法，去除其抑菌活性成分，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。為保證試驗(yàn)的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)嚴(yán)格按照《中國(guó)藥典》規(guī)定，選擇5種菌株進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，采用薄膜過(guò)濾法可有效消除紅藤消炎灌腸液抑菌作用，各菌回收率均＞70% ，同時(shí)控制菌的檢查方法能有效檢出控制菌，該方法適合紅藤消炎灌腸液的微生物限度檢查。

［1］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2010年版(二部)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄 XIJ，107.

［3］曹雄偉.最新藥品微生物檢驗(yàn)方法與操作標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范及無(wú)菌隔離技術(shù)實(shí)用手冊(cè).上卷［S］.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2009:261.

［4］陳華龍，王莉蓓，譚莉萍.姜膽咳喘片微生物限度檢查方法的驗(yàn)證［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，(11):67.