中醫(yī)藥對(duì)小兒急性非細(xì)菌感染性腹瀉病的療效及腸道微生態(tài)的影響※

● 胡小英 許 華 陳曉剛 劉 華 張媛媛 丘小汕 肖達(dá)民 潘瑞芳 黃 蓓

腹瀉病是小兒常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，尤以嬰幼兒發(fā)病率最高，并以非細(xì)菌感染性腹瀉為主，該病是造成小兒營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)發(fā)育障礙和死亡的主要原因之一［1］。本課題組進(jìn)行了中醫(yī)藥療法對(duì)小兒急性非細(xì)菌感染性腹瀉病的療效及腸道微生態(tài)觀察，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料

1.1 臨床資料 病例來(lái)源于2007年9月～2010年12月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、廣州市兒童醫(yī)院、中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院、廣州市中醫(yī)院診治的6個(gè)月～3歲急性非細(xì)菌感染性腹瀉病患兒共359例。采用前瞻性隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn);采用中心隨機(jī)化分配系統(tǒng)進(jìn)行隨機(jī)分組，分為試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組、對(duì)照組三組;數(shù)據(jù)庫(kù)收集處理及統(tǒng)計(jì)分析均由第三方執(zhí)行。其中，試驗(yàn)A組入組119例，脫落2例，剔除2例;試驗(yàn)B組入組116例，脫落5例，剔除0例;對(duì)照組入組124例，脫落2例，剔除3例。共351例納入FAS集分析，345例納入PPS集分析，359例納入SS集分析。其中，三組病例的脫落剔除率分別為3.36%、4.31%、4.03%，年齡(歲)分別是 1.15±0.58、1.24±0.67、1.13 ±0.64，性別(男/女)比例分別是 82/34、81/34、71/49，體重(KG)分別是 9.84±1.77、10.09 ±1.93、9.5±1.82，體溫(℃)分別是 37.02±0.7、36.92±0.67、37±0.77，呼吸(次/分)分別是 28.54 ±4.24、28.21±4.25、29.23 ±4.66，靜息心率(次/分)分別是114.91±10.49、114.08 ±9.29、116.49 ±10.34，病情(輕/中)例數(shù)比例分別是 113/2、110/1、116/3，病程(天)分別是2.36±2.21、2.59±2.21、2.55±2.41，中醫(yī)證候分布(濕熱證/傷食證/風(fēng)寒證/脾虛證)例數(shù)比例分別是 72/14/19/10、73/13/13/12、71/16/19/13，依從性(好/差)分別是 115/0、110/1、119/0。三組病例的脫落剔除率、人口學(xué)特征(年齡、性別構(gòu)成、體重)、治療前生命體征(體溫、呼吸、靜息心率)、病情分級(jí)、病程、中醫(yī)證候分布、依從性、治療前糞便標(biāo)本中雙歧桿菌和大腸桿菌及乳酸菌的數(shù)量(詳見(jiàn)表2)、治療前乳酸菌/大腸桿菌比值和雙歧桿菌/大腸桿菌比值(詳見(jiàn)表3)等方面，經(jīng)檢驗(yàn)，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，故三組具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒發(fā)的《中國(guó)腹瀉病診斷治療方案》［2］實(shí)施。

1.2.2 中醫(yī)診斷及證型診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照普通高等教育“十五”國(guó)家級(jí)規(guī)劃教材《中醫(yī)兒科學(xué)》［3］及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［4］中泄瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)擬定，分為濕熱證、傷食證、風(fēng)寒證、脾虛證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)、病情為輕中型者;(2)符合中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)者;(3)年齡為出生后6個(gè)月至3歲(含3歲);(4)輪狀病毒腸炎病程在3d之內(nèi)者(含3d);(5)患兒法律監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)，同意納入本研究。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)細(xì)菌感染性腹瀉;(2)合并心腦血管、肝腎及造血系統(tǒng)等嚴(yán)重威脅生命的原發(fā)疾病、原發(fā)性免疫缺陷疾病及精神、神經(jīng)疾病患兒;(3)有重度脫水或嚴(yán)重中毒癥狀者。

2 方法

2.1 治療方法 試驗(yàn)A組:口服中藥湯劑(運(yùn)脾化濕方辨證加味)+基礎(chǔ)治療。試驗(yàn)B組:口服中藥湯劑(運(yùn)脾化濕方辨證加味)+小兒推拿療法+基礎(chǔ)治療。對(duì)照組:口服蒙脫石散(商品名:思密達(dá)，博福－益普生(天津)制藥有限公司)+基礎(chǔ)治療。

2.1.1 中藥處方 運(yùn)脾化濕方:陳皮5g，蒼術(shù)8g，厚樸8g，茯苓10g，山楂炭10g，甘草4g。濕熱證:運(yùn)脾化濕方+葛根15g，黃芩10g，黃連5g，火炭母15g，雞蛋花15g。傷食證:運(yùn)脾化濕方+神曲10g，連翹10g，半夏10g，車前子10g，火炭母15g，雞蛋花15g。風(fēng)寒證:運(yùn)脾化濕方 +藿香10g，大腹皮10g，紫蘇10g，半夏10g，神曲10g，澤瀉10g。脾虛證:運(yùn)脾化濕方+太子參 10g，白術(shù) 10g，木香 5g，炒內(nèi)金 10g，炒扁豆 15g。

所有藥物由課題負(fù)責(zé)單位廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院統(tǒng)一購(gòu)買、配制，中藥煎劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備，用ZKJ－1A10型智控煎藥機(jī)(韓國(guó)和印株式會(huì)社)煎煮至150ml，真空無(wú)菌包裝，由專人配送到各研究單位，各參加單位均指派專人負(fù)責(zé)藥物分配及管理。

服法:6個(gè)月 ～1歲:每次30ml，每日3次;1～2歲，每次40ml，每日3次;1～3歲:每次50ml，每日3次;將湯藥取出復(fù)溫后口服。

2.1.2 小兒推拿療法 濕熱證、傷食證、風(fēng)寒證為實(shí)證采用實(shí)證小兒推拿手法;脾虛證為虛證采用虛證小兒推拿手法。

2.1.3 蒙脫石散服法 6個(gè)月～1歲，每次1g(1/3包)，每天3次;1～2歲，每次1.5g(1/2包)，每天3次;1～3歲，每次2g(2/3包)，每天3次。

2.1.4 基礎(chǔ)治療 包括飲食指導(dǎo)及合理補(bǔ)液。

2.1.5 療程 3天。

2.2 觀察指標(biāo) 腸道微生態(tài)檢測(cè)分析:分別于治療前、后采用基于Taqman技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法［5，6］，對(duì)所有病例兒童糞便標(biāo)本中的腸道雙歧桿菌，大腸桿菌和乳酸菌DNA進(jìn)行熒光定量(以每g濕糞中桿菌DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值表示)，比較各組治療前、后及組間腸道雙歧桿菌、大腸桿菌和乳酸菌數(shù)量的變化。

2.3 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 參照全國(guó)腹瀉病防治學(xué)術(shù)研討會(huì)組織委員會(huì)制定的《腹瀉病療效判斷標(biāo)準(zhǔn)及補(bǔ)充建議》［7］的療效判定標(biāo)準(zhǔn)制定。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。組間采用wilcoxon檢驗(yàn)、fisher精確檢驗(yàn)或方差分析分析，組內(nèi)差異采用配對(duì)T檢驗(yàn)或秩和符號(hào)檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 療效分析 FAS分析與PPS分析結(jié)果一致。

試驗(yàn)A組有30.17%的病例療效為顯效、68.97%有效，試驗(yàn) B組34.78%顯效、65.22%有效，對(duì)照組14.17%顯效、85.83%有效，顯效率三組間比較P=0.0004＜0.05，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;試驗(yàn)A組與對(duì)照組比較P=0.0059、試驗(yàn)B組與對(duì)照組比較P=0.0002均＜0.05，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;試驗(yàn)A組與試驗(yàn)B組比較P=0.3831＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 療效分析(PPS)(n·%)

3.2 腸道微生態(tài)分析 FAS分析與PPS分析結(jié)果一致。

3.2.1 治療前后組內(nèi)雙歧桿菌、大腸桿菌、乳酸菌數(shù)量的比較 見(jiàn)表2。

3.2.1.1 試驗(yàn)A組 雙歧桿菌P=0.3843＞0.05;大腸桿菌 P=0.0719＞0.05;乳酸菌 P=0.5024＞0.05，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.1.2 試驗(yàn)B組 雙歧桿菌P=0.6628＞0.05;大腸桿菌P=0.3639＞0.05;乳酸菌P=0.2230＞0.05，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.1.3 對(duì)照組 雙歧桿菌P=0.6268＞0.05;大腸桿菌P=0.5434＞0.05;乳酸菌P=0.2286＞0.05，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.2 治療后組間雙歧桿菌、大腸桿菌、乳酸菌數(shù)量的比較 見(jiàn)表2。

3.2.2.1 試驗(yàn)A組與試驗(yàn)B組比較 雙歧桿菌P=0.9891＞0.05;大腸桿菌P=0.6365＞0.05;乳酸菌P=0.5781＞0.05，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.2.2 試驗(yàn)A組與對(duì)照組比較 雙歧桿菌P=0.0921＞0.05;大腸桿菌P=0.4827＞0.05;乳酸菌P=0.0572＞0.05，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.2.3 試驗(yàn)B組與對(duì)照組比較 雙歧桿菌P=0.0892＞0.05;大腸桿菌P=0.8114＞0.05，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。乳酸菌P=0.0164＜0.05，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.2.4 三組間比較 雙歧桿菌P=0.1496＞0.05;大腸桿菌P=0.7767＞0.05，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。乳酸菌P=0.0310＜0.05，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 三組治療前后糞便標(biāo)本中雙歧桿菌、大腸桿菌和乳酸菌比較表(PPS)(log拷貝數(shù)/克濕糞，±s)

表2 三組治療前后糞便標(biāo)本中雙歧桿菌、大腸桿菌和乳酸菌比較表(PPS)(log拷貝數(shù)/克濕糞，±s)

注:*試驗(yàn)B組與對(duì)照組比較，P＜0.05;#三組間比較，P＜0.05。

雙歧桿菌 大腸桿菌 乳酸菌試驗(yàn)A組 116 治療前組別 n 7.39 ±1.61 8.45 ±1.37 8.21 ±1.23治療后 6.6 ±1.81 8.22 ±1.5 7.92 ±1.2試驗(yàn)B組 115 治療前 7.34±1.8 8.31±1.6 7.83±1.38治療后 6.87 ±1.96 8.03 ±1.69 8.1 ±1.04對(duì)照組 120 治療前 6.79±1.9 7.69±1.96 7.89±1.33治療后 5.75 ±2.27 7.93 ±1.76 7.31 ±1.38*#

3.2.3 乳酸菌/大腸桿菌比值分析 治療后試驗(yàn)A組與試驗(yàn)B組比較P=0.3107＞0.05;試驗(yàn)A組與對(duì)照組比較P=0.6603＞0.05;試驗(yàn)B組與對(duì)照組比較P=0.1800＞0.05;三組間比較 P=0.3404＞0.05，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

3.2.4 雙歧桿菌/大腸桿菌比值分析 治療后試驗(yàn)A組與試驗(yàn)B組比較P=0.3945＞0.05;試驗(yàn)A組與對(duì)照組比較P=0.2994＞0.05;試驗(yàn)B組與對(duì)照組比較P=0.1267＞0.05;三組間比較P=0.2533＞0.05，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 三組治療后糞便標(biāo)本中乳酸菌與大腸桿菌、雙歧桿菌與大腸桿菌比值分析(PPS)(±s)

表3 三組治療后糞便標(biāo)本中乳酸菌與大腸桿菌、雙歧桿菌與大腸桿菌比值分析(PPS)(±s)

注:各組治療后比較，均P＞0.05

雙歧桿菌/大腸桿菌試驗(yàn)A組 116 治療前組別 n 乳酸菌/大腸桿菌0.98 ±0.2 0.89 ±0.22治療后 0.99 ±0.2 0.79 ±0.23試驗(yàn) B組 115 治療前 0.97±0.22 0.87±0.24治療后 1.05 ±0.24 0.82 ±0.24對(duì)照組 120 治療前 1.07±0.3 0.89±0.3治療后0.96 ±0.19 0.72 ±0.3

4 討論

小兒非細(xì)菌感染性腹瀉病屬中醫(yī)“泄瀉”范疇。中醫(yī)藥治療小兒泄瀉病積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，內(nèi)治法有辨證論治、基本方加減以及專病專藥臨床研究［8－10］;外治以針灸、穴位注射、敷貼、推拿等以及內(nèi)服外治療法的研究等［11－14］，臨床報(bào)道取得良好效果。本課題組長(zhǎng)期致力于小兒脾胃病的研究，對(duì)中醫(yī)藥治療小兒泄瀉進(jìn)行了多方位的觀察與總結(jié)，認(rèn)為脾虛濕盛是小兒泄瀉的病機(jī)關(guān)鍵，總結(jié)出以運(yùn)脾化濕為主法、辨證治療小兒泄瀉的中醫(yī)藥治療方案。方案中內(nèi)治法采用運(yùn)脾化濕方辨證加味，本方重用蒼術(shù)運(yùn)脾燥濕，宣陽(yáng)化濁;茯苓健脾利濕，二者相合，相輔相成，脾氣健運(yùn)則水濕自除;配以陳皮、厚樸芳香化濕、調(diào)理氣機(jī);陳皮與蒼術(shù)相合，復(fù)中焦脾胃運(yùn)化升降之職;厚樸與蒼術(shù)合用，蒼術(shù)燥濕為主，厚樸行氣為輔，二藥相須為用，化濕濁，健脾胃，升脾氣，降胃氣，相得益彰，合奏運(yùn)脾化濕、行氣和胃之功。再輔以山楂炭酸斂止瀉，使?jié)駶峄⑦\(yùn)復(fù)健，升降調(diào)而清濁得分，達(dá)到止瀉之效。外治法為配合虛實(shí)辨證推拿手法。經(jīng)臨床觀察證實(shí)本中醫(yī)藥療法對(duì)小兒急性非細(xì)菌感染性腹瀉病具有良好的治療作用，療效優(yōu)于蒙脫石散對(duì)照組。

近年來(lái)，對(duì)小兒腹瀉病微生態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，微生態(tài)失衡在腹瀉病發(fā)病機(jī)理中起重要作用［15－17］，腹瀉患兒腸內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)存在嚴(yán)重失衡，而濫用抗生素將使腸內(nèi)菌群紊亂，進(jìn)一步破壞腸道微生態(tài)平衡。本組分別在治療前、后進(jìn)行應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)病例糞便標(biāo)本中雙歧桿菌、大腸桿菌、乳酸菌的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)及比對(duì)，結(jié)果顯示除乳酸菌數(shù)量治療后三組間及試驗(yàn)B組與對(duì)照組組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)外，其余乳酸菌、雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量治療前后組內(nèi)及治療后組間比較、乳酸菌/大腸桿菌比值及雙歧桿菌/大腸桿菌比值治療后組間比較均無(wú)差異。本組研究說(shuō)明口服中藥、小兒推拿、口服西藥思密達(dá)對(duì)患兒腸道雙歧桿菌、大腸桿菌、乳酸菌的早期恢復(fù)影響均不明顯，可能中醫(yī)藥、西藥治療在短期內(nèi)均無(wú)法糾正小兒急性非細(xì)菌感染性腹瀉病的腸道菌群失衡。提示患兒臨床早期恢復(fù)可能存在其他作用機(jī)制靶點(diǎn)。此外也可能與本研究標(biāo)本采集節(jié)點(diǎn)過(guò)早，以及單純進(jìn)行個(gè)別菌種的檢測(cè)并不能完整準(zhǔn)確地反映腸道整體微生物群落的情況等有關(guān)。

近來(lái)，國(guó)外學(xué)者提出了以序列分析為基礎(chǔ)的宏基因組學(xué)(me tagenomics)方法，所謂宏基因組，是指自然環(huán)境中全部微生物基因組的總和，借助于新一代測(cè)序技術(shù)，在大規(guī)模基因序列分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物信息學(xué)工具，實(shí)現(xiàn)對(duì)宏基因組中相關(guān)基因的定量分析和功能預(yù)測(cè)，這被認(rèn)為是微生物研究的革命性突破［18］，將為本研究的進(jìn)一步深入提供了更好的方法。

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