食管鱗癌組織中TIG1基因甲基化及其mRNA表達(dá)的研究

童 強(qiáng)， 劉曉波△， 羅和生， 李勝保， 余宗濤， 張吉才， 高 波， 蒙建超

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 1消化內(nèi)科，3檢驗(yàn)部，湖北 十堰442000;2武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢430060)

全世界每年大約有48萬(wàn)食管癌(esophageal carcinoma，EC)新患病例，超過40萬(wàn)人死于該病，主要有2種類型:好發(fā)于中上段的食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous－cell carcinoma，ESCC)及好發(fā)于食管下段1/3區(qū)域及賁門部的食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EA)［1］。食管癌的發(fā)生是遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)共同作用的結(jié)果，表觀遺傳學(xué)研究的是基因組DNA序列未改變的情況下，基因發(fā)生可遺傳的改變并導(dǎo)致個(gè)體表型變化的學(xué)說(shuō)。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要組成部分，不同腫瘤中DNA甲基化模式有差異［2］。對(duì)食管癌甲基化模式的探索，可以用于早期診斷、化療療效預(yù)測(cè)、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的評(píng)估等［3－5］。

他扎羅汀(tazarotene)可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生他扎羅汀誘導(dǎo)基因(tazarotene－induced gene，TIG)1、2 和3［6］。TIG1 基因又名視黃酸受體應(yīng)答因子－1(retinoic acid receptor responder－1，RARRES1)，集中在人類的3號(hào)染色體的短臂，位于3p12和3p13之間，其cDNA可以編碼含228個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白N端的胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)，以及C端胞外區(qū)含有糖基化信號(hào)［7］。在其它癌組織如胃癌、膀胱癌、前列腺癌［8－10］等中TIG1基因均發(fā)生高度甲基化，且甲基化水平明顯高于正常組織和良性增生，基因TIG1失表達(dá)與其啟動(dòng)子異常甲基化密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylationspecific PCR，MSP)法及實(shí)時(shí)定量RT－PCR(real－time fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q－PCR)檢測(cè)食管鱗癌組織、癌旁組織及正常組織中TIG1基因的甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)水平，比較不同來(lái)源的食管組織中TIG1基因的甲基化水平，分析基因甲基化水平與mRNA表達(dá)之間的關(guān)系，以期進(jìn)一步探討TIG1基因在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對(duì)象 收集湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院2010年2月～2011年12月間手術(shù)切除的食管癌組織43例、癌旁組織(距腫瘤邊緣2.5 cm以上)20例及15例收集自胃鏡室的食管正常組織，結(jié)果均經(jīng)病理證實(shí)，標(biāo)本在獲得后立即放置液氮中保存，研究中所有患者均知情同意。所有腫瘤患者術(shù)前未行放化療治療，患者年齡38～75歲，平均59.2歲，詳細(xì)資料見表1。

1.2 主要試劑和儀器 TRIzol reagent(Invitrogen);Tis－飽和酚(北京索萊寶);5－Aza－CdR和亞硫酸氫鈉(Sigma);SYBR GreenⅠ染料(Gene);Wizard DNA Clean－Up Systerm純化試劑盒和Reverse Transcription System A3500(Promega);PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工);DNA marker(北京天根);蛋白酶K、糖原和鮭精DNA(華美);ND－2000微量核酸定量?jī)x(NanoDrop);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(日立);ABI PRISM7500(ABI);G－BOX紫外凝膠成像系統(tǒng)(Gene)。

1.3 引物 均由北京賽百盛生物公司合成。TIG1基因甲基化引物［11］:甲基化 M(118 bp)上游引物 5＇－GTAGTACGGGCGGGT CGC－3＇，下游引物 5＇－GACATCGCCTCCGCAACG－3＇;非甲基化 U(134 bp)上游引物 5＇－GAGGTAGTATGGGTGGGTTGT－3＇，下游引物 5＇－AATACTAAAATACAACATCACCTCCA－3＇。TIG1 mRNA［11］(134 bp)上游引物 5＇－GAAAAACCCCTTGGAAATAGTCAGC－3＇，下游引物 5＇－AGTGTGACACCTGTGTTGTCATTTCC－3＇;GAPDH mRNA［12］(226 bp)上游引物 5＇－GAAGGTGAAGGTCGGAGTC－3＇，下游引物5＇－GAAGATGGTGATGGGATTTC－3＇。

表1 食管鱗癌組織中TIG1基因甲基化狀態(tài)及其相應(yīng)的臨床病理特征Table 1.The methylation status of TIG1 gene in esophageal squamous－cell carcinoma tissues and its correlation with clinicopathological features

2 研究方法及步驟

2.1 DNA甲基化檢測(cè)

2.1.1 DNA的磺化修飾 以酚/氯仿法提取各食管組織的DNA，并對(duì)其行亞硫酸氫鹽修飾。修飾步驟參照［13］:檢測(cè)所提取的DNA濃度，計(jì)算4 μg DNA相應(yīng)體積，用ddH2O補(bǔ)齊至總體積50 μL，100℃加熱10 min，立即放入冰塊內(nèi)5 min，加入3.0 mol/L 的 NaOH 5.5 μL，置入 37 ℃水箱中孵化 30 min。向處理后的DNA中加入10 mmol/L的臨時(shí)配置的氫醌30 μL 和3.0 mol/L 的亞硫酸氫鈉 520 μL，輕輕混勻，加入200 μL無(wú)菌礦物油覆蓋液面，放入55℃的水浴箱內(nèi)16 h。取出標(biāo)本，離心后吸出無(wú)菌礦物油，將修飾后的DNA用Wizard DNA Clean－Up Systerm純化體系混勻、過柱，經(jīng)脫鹽、純化回收，洗脫進(jìn)50 μL的雙蒸水中。向標(biāo)本中加入3 mol/L NaOH 5.5 μL，于37℃的水浴箱內(nèi)15 min脫硫化基團(tuán)，加入10 mol/L NH4Ac 56 μL，靜置 5 min 后，加入 5 g/L 糖原、1 μL鮭精DNA、2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA，將標(biāo)本置入－20℃的冰箱內(nèi)過夜沉淀。將標(biāo)本離心，用75%預(yù)冷的乙醇洗滌2次，棄上清，得DNA沉淀，經(jīng)干燥后加入30 μL的雙蒸水內(nèi)溶解，于－80℃的冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 MSP檢測(cè)TIG1基因的甲基化狀態(tài) 30 μL的擴(kuò)增體系:DNA 3 μL，2 mmol/L dNTP 1.5 μL，10 × PCR 緩沖液 3 μL，25 mmol/L MgCl22.4 μL，上、下游引物各1.7 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.3 μL，20 × SYBR Green I 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至30 μL。置于ABI PRISM7500擴(kuò)增，條件為:95℃ 5 min;然后95℃ 30 s，M引物56℃ 45 s(U引物61℃)，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。取 10 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，用2.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用凝膠分析儀拍照分析。

2.2 FQ－PCR法檢測(cè)TIG1mRNA的表達(dá)

2.2.1 RNA提取及cDNA的合成 按照TRIzol reagent說(shuō)明書提取總RNA，以1 μg(約2 μL)總RNA作為模板，依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒A3500說(shuō)明書配制20 μL的反應(yīng)體系后放入PCR儀中，反應(yīng)條件:42℃ 15 min，95℃ 5 min，而后立即放置冰塊上備用。

2.2.2 SYBR Green I FQ－PCR 將新合成的 cDNA用無(wú)RNA酶的ddH2O稀釋至100 μL，行 PCR 擴(kuò)增，30 μL的擴(kuò)增體系:2 mmol/L dNTP 2 μL，10 × PCR 緩沖液3 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，上、下游引物各 2 μL，5 U/μL Taq 酶 0.5 μL，20× SYBR Green I 0.5μL，稀釋后 cDNA 5 μL，滅菌 ddH2O 補(bǔ)齊至30 μL。將反應(yīng)體系置于ABI PRISM7500內(nèi)擴(kuò)增:95℃變性5 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，最后一循環(huán)72℃時(shí)讀熒光值;72℃ 5 min，取擴(kuò)增產(chǎn)物行2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

2.3 TIG1 mRNA的相對(duì)定量 以GAPDH為內(nèi)參照，采用實(shí)驗(yàn)測(cè)定Ct值及擴(kuò)增效率E，計(jì)算TIG1 mRNA的相對(duì)定量值:TIG1 mRNA/GAPDH mRNA=(1+EGAPDH)CtGAPDH/［(1+ETIG1)CtTIG1］［14］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，基因甲基化數(shù)據(jù)處理采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)n＜40或理論頻數(shù)＜1時(shí)采用Fisher's exact test;TIG1 mRNA相對(duì)定量結(jié)果以中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))表示，組間差異比較采用 Kruskal－Wallis檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各食管組織中TIG1基因甲基化狀態(tài)

43例食管鱗癌組織25.6%(11/43)甲基化陽(yáng)性，顯著高于癌旁組織陽(yáng)性率5%(1/20)(P＜0.05);正常組織中未檢測(cè)到基因甲基化(0/15)，與鱗癌組織比較差異顯著(P＜0.05)。

2 食管鱗癌組織中TIG1基因甲基化狀態(tài)與患者臨床病理特征關(guān)系

如表1所示，性別、年齡、病變部位和分化程度不同的患者TIG1基因甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);T1～2分期組織甲基化陽(yáng)性率較T3期低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示該基因甲基化程度與患者TNM分期有關(guān)，晚期組織樣本甲基化程度高;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組較陰性組陽(yáng)性甲基化率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明組織甲基化與是否伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。食管鱗癌組織M及U擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

Figure 1.Electrophoretogram of TIG1 promoter methylation status in esophageal squamous－cell carcinoma tissues.DW:double－distilled water;M:methylated primer product;U:unmethylated primer product;A:completely methylated sample;B:partially methylated sample;C:unmethylated sample.圖1 食管鱗癌組織中TIG1基因甲基化狀態(tài)電泳圖

3 食管鱗癌組織、癌旁組織及正常組織中TIG1 mRNA缺失及相對(duì)定量比較

如表2示，鱗癌組織中TIG1 mRNA表達(dá)相對(duì)定量值顯著低于癌旁組織(P＜0.05)及正常組織(P＜0.01);癌旁組織與正常組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明2組基因表達(dá)水平相當(dāng);甲基化組顯著低于非甲基化組(P＜0.01)，表明甲基化是導(dǎo)致基因表達(dá)缺失重要原因。

討 論

食管癌是起源于食管黏膜的惡性腫瘤。它以基因及表觀遺傳學(xué)變化為起始，繼而多種癌基因激活、抑癌基因失活［15］，最終導(dǎo)致功能蛋白的下調(diào)和缺失。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，主要包括啟動(dòng)子區(qū)高甲基化、全部基因組低甲基化以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶異常表達(dá)［16］，可以參與多種重要的生命過程。包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤均有不同程度、不同形式的DNA甲基化異常［17］。表觀遺傳學(xué)變化與組織病理學(xué)變異水平具有相關(guān)性［18］。啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化是可以抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)甚至沉默，進(jìn)而引發(fā)下游事件，導(dǎo)致正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化調(diào)控失常，這一機(jī)制與多種腫瘤的形成密切相關(guān)［19－20］。

表2 食管鱗癌組織、癌旁組織及正常組織中TIG1 mRNA表達(dá)的變化Table 2.The expression level of TIG1 mRNA in esophageal tissues，paracancerous tissues and normol tissues

TIG1蛋白有TIG1A及TIG1B兩種異構(gòu)體，TIG1B可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與入侵能力，腫瘤組織中TIG1B的表達(dá)水平大多降低，在正常前列腺和結(jié)腸組織TIG1兩個(gè)異構(gòu)體均有表達(dá)，而結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)降低。結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)TIG1異構(gòu)體使TIG1A和TIG1B均有穩(wěn)定表達(dá)后，其生長(zhǎng)顯著受抑制，表明TIG1基因及其異構(gòu)體TIG1A及TIG1B可能為抑癌基因［21］。Kwol等［22］證實(shí)鼻咽癌細(xì)胞株經(jīng)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)TIG1基因后，較TIG1表達(dá)陰性細(xì)胞株生長(zhǎng)顯著抑制(P＜0.05)，而表達(dá)該基因的細(xì)胞株敲除TIG1基因后較未敲除的細(xì)胞增殖顯著增加(P＜0.01)，提示TIG1基因表達(dá)降低可能與鼻咽癌的發(fā)生有關(guān)。Son等［9］報(bào)道晚期胃癌TIG1表達(dá)缺失或減少較早、中期腫瘤顯著;低分化組織缺失或減少較高、中分化顯著。TIG1基因表達(dá)缺失的細(xì)胞株經(jīng)去甲基化制劑5－Aza－CdR處理后，TIG1可以恢復(fù)表達(dá)或原有的表達(dá)水平提高，表明TIG1經(jīng)歷頻繁的異常甲基化導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)失活，它的表達(dá)變化與胃癌的進(jìn)展有關(guān)。

本研究采用MSP檢測(cè)各食管組織TIG1基因甲基化狀態(tài)，鱗癌組織甲基化率為25.6%(11/43)，癌旁組織為5%(1/20)，正常組織中未檢測(cè)到基因甲基化，表明隨著組織惡性程度的增加，甲基化率增高。我們還發(fā)現(xiàn)鱗癌組織中TIG1基因甲基化多發(fā)生在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.05)和TNM分期晚期(P＜0.01)的患者。該結(jié)果與Mizuiri等［23］的報(bào)道有出入，可能是不同人種患者流行病學(xué)及腫瘤發(fā)病機(jī)制有差異導(dǎo)致，根本原因有待進(jìn)一步研究證實(shí)。不同甲基化水平的基因可以作為預(yù)測(cè)腫瘤的分期及轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記物［24］，我們推測(cè)TIG1基因甲基化不僅導(dǎo)致了TIG1基因的表達(dá)異常，而且與食管鱗癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，TIG1基因啟動(dòng)子甲基化多發(fā)生在晚期腫瘤患者，提示檢測(cè)組織TIG1基因甲基化狀態(tài)可以用于患者腫瘤分期及轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子。

基因表達(dá)定量結(jié)果顯示鱗癌組織基因表達(dá)缺失率為53.5%(23/43)，11例甲基化的標(biāo)本中TIG1 mRNA表達(dá)缺失率為81.8%(9/11)，mRNA表達(dá)相對(duì)定量顯示甲基化組表達(dá)量顯著低于非甲基化組，表明TIG1基因表達(dá)缺失與其異常甲基化有關(guān)，異常甲基化導(dǎo)致TIG1表達(dá)失活。同時(shí)，我們還注意到鱗癌組織中非甲基化組織TIG1基因亦有不同程度的基因表達(dá)缺失，可能有可能原因?yàn)槟[瘤組織中TIG1基因組DNA已發(fā)生甲基化，但尚未檢測(cè)到;另外，基因表達(dá)缺失是遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)共同作用的結(jié)果，考慮DNA甲基化之外的原因引起TIG1基因表達(dá)缺失和(或)降低，有待進(jìn)一步研究明確。本文證實(shí)DNA甲基化是導(dǎo)致抑癌基因TIG1表達(dá)降低及失活的重要原因，相信隨著研究的不斷深入，TIG1基因的重要作用以及其表達(dá)缺失在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用將進(jìn)一步為人們所認(rèn)識(shí)。

［1］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69－90.

［2］ Li LW，Yu XY，Li XY，et al.Mechanism of loss of human esophageal cancer－related gene 4(ECRG4)gene expression in esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2011，33(8):570－573.

［3］ Gyobu K，Yamashita S，Matsuda Y，et al.Identification and validation of DNA methylation markers to predict lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinomas［J］.Ann Surg Oncol，2011，18(4):1185－1194.

［4］ Ling ZQ，Zhao Q，Zhou SL，et al.MSH2 promoter hypermethylation in circulating tumor DNA is a valuable predictor of disease－free survival for patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］.Eur J Surg Oncol，2012，38(4):326－332.

［5］ Liu J B，Qiang FL，Dong J，et al.Plasma DNA methylation of Wnt antagonists predicts recurrence of esophageal squamous cell carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2011，17(44):4917－4921.

［6］ Zheng Y，Luo S，Wang G，et al.Downregulation of tazarotene induced gene－2(TIG2)in skin squamous cell carcinoma［J］.Eur J Dermatol，2008，18(6):638－641.

［7］ Nagpal S，Patel S，Asano AT，et al.Tazarotene－induced gene 1(TIG1)，a novel retinoic acid receptor－responsive gene in skin［J］.J Invest Dermatol，1996，106(2):269－274.

［8］ Vasiljevic＇N，Wu K，Brentnall AR，et al.Absolute quantitation of DNA methylation of 28 candidate genes in prostate cancer using pyrosequencing［J］.Dis Markers，2011，30(4):151－161.

［9］ Son MS，Kang MJ，Park HC，et al.Expression and mutation analysis of TIG1(tazarotene－induced gene 1)in human gastric cancer［J］.Oncol Res，2009，17(11－12):571－580.

［10］ Esteller M，Guo M，Moreno V，et al.Hypermethylationassociated inactivation of the cellular retinol－bindingprotein 1 gene in human cancer［J］.Cancer Res，2002，62(20):5902－5905.

［11］ Youssef EM，Chen XQ，Higuchi E，et al.Hypermethylation and silencing of the putative tumor suppressor Tazarotene－induced gene 1 in human cancers［J］.Cancer Res，2004，64(7):2411－2417.

［12］ Kanai Y，Ushijima S，Kondo Y，et al.DNA methyltransferase expression and DNA methylation of CPG islands and peri－centromeric satellite regions in human colorectal and stomach cancers［J］.Int J Cancer，2001，91(2):205－212.

［13］ Zhang J，Yu Z.Lü J，et al.Persistent infection of hepatitis B virus is involved in high rate of p16 methylation in hepatocellular carcinoma［J］.Mol Carcinog，2006，45(7):530－536.

［14］ 余宗濤，高 瓊，張吉才，等.肺癌患者PTEN基因啟動(dòng)子甲基化和轉(zhuǎn)錄表達(dá)的研究［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，29(17):2163－2166.

［15］ Zhang XM，Guo MZ.The value of epigenetic markers in esophageal cancer［J］.Front Med China，2010，4(4):378－384.

［16］ Chen C，Yin N，Yin B，et al.DNA methylation in thoracic neoplasms［J］.Cancer Lett，2011，301(1):7－16.

［17］ Lima SC，Hernandez－Vargas H，Simao T，et al.Identification of a DNA methylome signature of esophageal squamous cell carcinoma and potential epigenetic biomarkers［J］.Epigenetics，2011，6(10):1217－1227.

［18］ Jing Z，Zou CL，Li G，et al.Aberrant methylation of T－cadherin gene in human esophageal carcinoma cells［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2011，91(37):2653－2656.

［19］ 王小韻，楊越波，李小毛，等.CHFR在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和甲基化調(diào)控［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27(9):1746－1750.

［20］ 郭艷麗，郭 煒，鄺 鋼，等.食管鱗狀細(xì)胞癌中SFRP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測(cè)［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27(2):278－283.

［21］ Wu CC，Tsai FM，Shyu RY，et al.G protein－coupled receptor kinase 5 mediates Tazarotene－induced gene 1－induced growth suppression of human colon cancer cells［J］.BMC Cancer，2011，11:175.

［22］ Kwok WK，Pang JC，Lo KW，et al.Role of the RARRES1 gene in nasopharyngeal carcinoma［J］.Cancer Genet Cytogenet，2009，194(1):58－64.

［23］ Mizuiri H，Yoshida K，Toge T，et al.DNA methylation of genes linked to retinoid signaling in squamous cell carcinoma of the esophagus:DNA methylation of CRBP1 and TIG1 is associated with tumor stage［J］.Cancer Sci，2005，96(9):571－577.

［24］ Sung CO，Han SY，Kim SH.Low expression of claudin－4 is associated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2011，18(1):273－281.