應(yīng)用亞硫酸鈉快速制備低氧性肺血管收縮離體模型所需低氧性Krebs－Henseleit液的方法及評(píng)價(jià)*

姚海霞， 祝 卿， 吉 偉， 王淑君， 王良榮， 林麗娜△， 王萬(wàn)鐵△

(溫州醫(yī)學(xué)院1附屬第一醫(yī)院麻醉科，2病理生理學(xué)教研室，浙江溫州325035)

在研究急性低氧對(duì)肺血管張力影響的實(shí)驗(yàn)中，如何使肺血管環(huán)迅速獲得穩(wěn)定的低氧環(huán)境是研究前提。以往，低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)研究多采用物理性低氧通氣法降低血管緩沖液Krebs-Henseleit(KH)液的氧分壓(oxygen partial pressure，PO2)，雖然此方法可對(duì)肺血管造成低氧相關(guān)性損傷，但卻必須配備裝有高精準(zhǔn)比例的氮?dú)夂投趸嫉膬?chǔ)氣瓶［1］，才能使血管KH液的PO2下降，而且在通入低氧氣體時(shí)要給浴槽加蓋保持密閉持續(xù)通氣很長(zhǎng)時(shí)間，這種密閉環(huán)境在掛著血管環(huán)的狀態(tài)下非常不易操作，而且通入氣體的時(shí)間和KH液的PO2無法精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)，不能保證每次實(shí)驗(yàn)達(dá)到的低氧條件都是一致。因此快速制備出HPV離體血管實(shí)驗(yàn)所需的穩(wěn)定的低氧性KH液具有重要意義。亞硫酸鈉(sodium sulfite，Na2SO3)作為一種主要的食品防腐劑，可快速去氧引發(fā)厭氧條件，從而有效地抑制好氧微生物的生長(zhǎng)，且缺氧的程度和Na2SO3溶液的保質(zhì)期容易控制［2-4］。本研究擬在暴露空氣的開放環(huán)境中將無水Na2SO3加至0.5 L KH液中，利用Na2SO3結(jié)合水溶液中溶解氧的能力，以期獲得一種快速制備低氧性KH液的新方法，應(yīng)用于肺血管急性低氧實(shí)驗(yàn)的離體研究。

材料和方法

1 材料

便攜式臨床分析儀 (型號(hào):2-35451，i-STAT Corporation);pH計(jì)(型號(hào):滬制01040055，梅特勒-托利多儀器上海有限公司);電熱恒溫水浴鍋(型號(hào):HH.521-4-5，上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);溫度計(jì);無水Na2SO3;KH液:0.5 L KH 液含 NaCl 3.2409 g，KCl 0.1752 g，MgSO40.1479 g ，NaHCO31.0501 g，KH2PO40.0816 g ，CaCl20.1387 g ，葡萄糖0.9000 g(上述試劑均為市售分析純級(jí))。

2 方法

2.1 選用8份雙蒸水配置0.5 L KH液(溫度:37℃，pH 7.30～7.45)。在暴露空氣的開放環(huán)境下，分別加入0(A1，對(duì)照組)、0.2(A2)、0.5(A3)、0.8(A4)、1.1(A5)、1.4(A6)、1.5(A7)、1.6 g(A8)的無水 Na2SO3攪拌充分溶解后，1 mol/L HCl調(diào)定 pH 7.30 ～7.45，二氧化碳分壓(carbon dioxide partial pressure，PCO2)35～45 mmHg。分別在加樣后1 min取樣行成分分析，選擇符合低氧條件(PO2降低到40 mmHg以下)的Na2SO3-KH液進(jìn)入以下研究。

2.2 根據(jù)加樣后1 min液體指標(biāo)測(cè)定，選擇1.5 g Na2SO3加至0.5 L KH液，充分溶解后，分別在加樣前和加樣后1、10、20、30、60、90 min 取樣行成分分析(pH、PCO2、PO2及 Na+濃度)。每次測(cè)定前先測(cè)定溶液pH，如pH超出范圍，先用HCl調(diào)節(jié)再測(cè)定各指標(biāo)。另外，由于Na2SO3進(jìn)入水中反應(yīng)生成等 mol的Na2SO4，含2倍mol的Na+，明顯增加KH液Na+濃度，為了防止溶液出現(xiàn)高滲，經(jīng)過換算把增加的Na+通過減少NaCl的量使Na+滲透壓保持在135～155 mmol/L，本實(shí)驗(yàn)把0.5 L KH液中加入的NaCl的劑量改為2.0563 g，其余成分的劑量不變。

2.3 根據(jù)上述方法，選擇1.5 g Na2SO3加至0.5 L KH液，充分溶解后，分別在加樣前和加樣后 0 h、1 h、2 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、、21 h、24 h 取樣進(jìn)行成分分析(pH、PCO2和PO2)，觀察低氧溶液24 h的變化。

2.4 方法同 2.2，選擇 1.5 g Na2SO3加至 0.5 L KH 液，充分溶解后，分別在加樣前和加樣后第1 d、第2 d、第3 d、第4 d、第 5 d、第6 d、第7 d、第8 d、第 9 d、第10 d、第11 d 取樣進(jìn)行成分分析(pH、PCO2和PO2)，觀察低氧溶液的維持狀態(tài)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同劑量的Na2SO3對(duì)0.5 L KH液PO2的影響

各組0.5 L KH液中加不同劑量Na2SO31 min后，與對(duì)照組(A1)相比，溶液PO2降低(P＜0.01)，且隨著Na2SO3劑量的增加，PO2降低明顯(P＜0.01)，pH和PCO2改變無顯著差異(P＞0.05)。其中A7組PO2均處于20～40 mmHg范圍，最適合HPV離體模型實(shí)驗(yàn)所需，見表1。

表1 溶入不同劑量Na2SO31 min后0.5 L KH液中pH、PCO2和PO2的變化Table 1.The values of pH，carbon dioxide partial pressure(PCO2)，oxygen partial pressure(PO2)after different doses of sodium sulfite(Na2SO3)dissolved in Krebs-Henseleit(KH)solution at 1 min(ˉx±s.n=8)

2 應(yīng)用1.5 g Na2SO3可使0.5 L KH溶液達(dá)到HPV所需的低氧性溶液并且可維持低氧狀態(tài)至少90 min

將1.5 g Na2SO3加入到0.5 L KH 液后PO2由(150.00 ±17.25)mmHg迅速降到(24.75 ±2.87)mmHg，加樣后20、30、60 min與1 min相比PO2改變未見顯著差異(P＞0.05)，而10 min與1 min相比PO2降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且90 min時(shí) PO2為(27.50±1.41)mmHg，與 1 min時(shí)相比有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但二者PO2數(shù)值仍處于20～40 mmHg范圍內(nèi)。各時(shí)點(diǎn)的PCO2多處于正常范圍(35～45 mmHg);pH處于正常范圍(7.30～7.45);Na+滲透壓均處于正常范圍(135～155 mmol/L)，見表2。此低氧條件已滿足急性HPV離體實(shí)驗(yàn)所需的低氧狀態(tài)的維持時(shí)間60 min。

3 應(yīng)用1.5 g Na2SO3達(dá)到的低氧狀態(tài)在24 h內(nèi)無變化

將1.5 g Na2SO3加入到0.5 L KH液后，加樣后各時(shí)點(diǎn)與1 min相比PO2和PCO2均無明顯變化(P＞0.05)，見圖1。

4 應(yīng)用1.5 g Na2SO3的低氧溶液PO2在加樣后第2 d開始上升，在第11 d上升至正常

將1.5g Na2SO3加入到0.5 L KH液后，第2 d之后的各時(shí)點(diǎn)與第1 d相比差異顯著(P＜0.05)，第11 d與未加樣前相比無顯著差異(P＞0.05)，見圖2。

表2 1.5 g Na2SO3溶入0.5 L KH液后各時(shí)點(diǎn)的 pH、PCO2、PO2和 Na+濃度的變化Table 2.The values of pH，PCO2，PO2，the concentration of Na+after 1.5 g Na2SO3dissolved in KH at various time points(ˉx±s.n=8)

Figure 1.Changes of PO2and PCO2after 1.5g Na2SO3dissolved in KH solution at various time points during the first day.ˉx±s.n=8.圖1 1.5 g Na2SO3溶入0.5 L KH 液后第 1 d(24 h)內(nèi)各時(shí)點(diǎn)PO2和PCO2的變化

Figure 2.Daily changes of PO2and PCO2after 1.5 g Na2SO3 dissolved in KH solution.ˉx±s.n=8.*P＜0.05 vs 1 d.圖2 1.5 g Na2SO3溶入0.5 L KH液后每天PO2和PCO2的變化

討 論

HPV是近年研究熱點(diǎn)，常見于當(dāng)肺泡氧分壓降到某一臨界值，肺血管發(fā)生快速、可逆的收縮反應(yīng)，以糾正肺泡通氣/灌流的不匹配，從而在不明顯改變肺動(dòng)脈壓的情況下最大程度地提高機(jī)體氧分壓。短時(shí)間內(nèi)的HPV對(duì)機(jī)體是一種保護(hù)機(jī)制，但長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作HPV卻是肺動(dòng)脈高壓、肺源性心臟病的“元兇”，研究HPV機(jī)制對(duì)肺動(dòng)脈高壓和肺心病以及慢性阻塞性肺疾病等防治機(jī)制的基礎(chǔ)研究有重要意義。在離體肺血管實(shí)驗(yàn)中，如何快速有效地制備離體低氧模型所需的低氧性KH液是研究HPV的前提條件。目前多將離體肺血管置于低氧環(huán)境中，其基本實(shí)驗(yàn)條件為:PO220～40 mmHg，PCO235～45 mmHg，pH 7.30 ～7.45。常用造模方法為物理性低氧法，即肺血管環(huán)平衡穩(wěn)定后向器官浴槽中通入的常氧氣體(95%O2和5%CO2)轉(zhuǎn)換為無氧氣體(95%N2和5%CO2)，并且要浴槽口加蓋密封使浴槽中KH液PO2達(dá)到(40±10)mmHg。此方法不足之處首先是實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)換氣體條件時(shí)常出現(xiàn)時(shí)間和氣壓不同步，并且浴槽中KH液的PO2、PCO2和pH在各個(gè)時(shí)點(diǎn)無法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，不能控制PO2降低的程度，PO2達(dá)到要求的時(shí)點(diǎn)和氣體的流速不好把握，即使PO2達(dá)到要求，并不能完全保證PCO2在正常范圍內(nèi)。其次，當(dāng)達(dá)到所需要的低氧條件后，如果要進(jìn)行后期的藥物干預(yù)須經(jīng)浴槽口直接加藥物的話就不可避免地破壞密閉環(huán)境，大氣壓氧的影響使降低的PO2極易變化而不穩(wěn)定，影響實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。

Abudara等［5］和胡清華等［6］使用硫代硫酸鈉剝奪水溶液中的氧模擬低氧反應(yīng)，類似于物理性低氧。然而，硫代硫酸鈉容易自燃，它與水反應(yīng)是放熱反應(yīng)，反應(yīng)后生成Na2SO3和二氧化硫(SO2)。也有研究用氯化鈷與鐵(氧傳感途徑的重要因子)競(jìng)爭(zhēng)的機(jī)制制作化學(xué)性缺氧模型，但是氯化鈷是一種重金屬具有組織和細(xì)胞毒性［7］。研究報(bào)道［8］Na2SO3可以降低水溶液中的溶解氧濃度，并且能激活缺氧誘導(dǎo)因子-1調(diào)控途徑，表明Na2SO3是一種潛在的可模擬低氧應(yīng)激的刺激物［2］。并且 Na2SO3和水的反應(yīng)不自燃，也不產(chǎn)生 SO2，Na2SO3進(jìn)入水溶液中與氧反應(yīng)生成的硫酸鈉(Na2SO4)對(duì)機(jī)體的危害與低氧相比幾乎是沒有毒性的。因此Na2SO3相比硫代硫酸鈉更有優(yōu)勢(shì)［2］。

本研究結(jié)果表明，在開放環(huán)境中，不同劑量Na2SO3可使0.5 L KH液PO2降低，并呈劑量依賴性，即溶液中Na2SO3的量越大，PO2就越低。從表1中可見尤其是加1.5 g Na2SO3可使PO2降低到40 mmHg以下，這個(gè)條件符合于離體肺血管低氧實(shí)驗(yàn)的研究條件。且1.5 g Na2SO3-KH低氧溶液暴露在空氣中90 min，發(fā)現(xiàn)PO2基本穩(wěn)定，而溶液pH值、PCO2和Na+滲透壓無明顯變化。這與完全去除溶解在1 L水中的溶解氧需要0.08 g Na2SO3［8］的理論相吻合，因?yàn)榇髿庋鯐?huì)逐漸地再溶解于水溶液中，低濃度的Na2SO3不可能完全去除水溶液中的溶解氧，按照前述的理論換算，0.5 L KH中加入的1.5 g Na2SO3中，其中0.04 g是用于去除水中的溶解氧，剩余的1.46 g是用于抑制大氣壓氧的再溶解從而保證其低氧狀態(tài)(20～40 mmHg)維持一定時(shí)間段。就這一點(diǎn)說，Na2SO3達(dá)到的低氧狀態(tài)在可控性和穩(wěn)定性上具有優(yōu)勢(shì);而且離體血管處于開放的環(huán)境，無需將浴槽加蓋，便于用一些特殊的儀器和試劑對(duì)血管進(jìn)行干預(yù)并作及時(shí)的觀察。因此，1.5 g Na2SO3加入0.5L KH液中充分溶解后，可滿足急性低氧性肺血管實(shí)驗(yàn)所需的低氧條件，并且維持此低氧狀態(tài)最少90 min，足以達(dá)到肺血管實(shí)驗(yàn)的急性低氧時(shí)間1 h。

此外，本研究結(jié)果3和4發(fā)現(xiàn)，1.5 g Na2SO3-KH低氧溶液的低氧狀態(tài)在24 h內(nèi)無變化，在第2 d PO2開始上升，在第11 d上升至正常值，低氧狀態(tài)最多可以維持24 h，足以達(dá)到HPV離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷募毙缘脱鯐r(shí)間1 h.

Jiang等［4］最新研究得出結(jié)論:Na2SO3能降低M9緩沖液中的溶解氧，是一種模擬低氧應(yīng)激的潛在因子，其誘發(fā)的低氧環(huán)境建造的線蟲低氧模型和物理性低氧模型一致，證明Na2SO3可以用于建造低氧實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯?，但并未具體驗(yàn)證Na2SO3是否可以用于血管、細(xì)胞或其它靶組織低氧實(shí)驗(yàn)的研究。因?yàn)檠?、?xì)胞等離體器官的實(shí)驗(yàn)其各自的緩沖液各不相同，如離體血管的緩沖液是 KH，離體細(xì)胞的培養(yǎng)液是DMEM液，線蟲的緩沖液則為M9緩沖液。各自緩沖液的成分比例差別很大。Jiang等［4］研究的Na2SO3降低M9緩沖液的氧程度和維持能力不一定與KH液和DMEM液相同，也許會(huì)因?yàn)槌煞值牟煌ハ嘤绊懚l(fā)生變化。因此Na2SO3是否可以用于制備血管或細(xì)胞的缺氧模型仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。因此，本研究是在Jiang等［4］的研究基礎(chǔ)上具體探索了Na2SO3是否可以用于制備低氧性肺血管收縮實(shí)驗(yàn)所需的低氧性KH液的可行性，并進(jìn)一步支持了Jiang等［4］的研究結(jié)果。本研究結(jié)果為開展Na2SO3在其它血管如主動(dòng)脈血管或腸系膜血管或細(xì)胞等靶器官低氧研究中的應(yīng)用提供了可能的依據(jù)，從而為解決低氧研究提供新方法和解決途徑。本研究測(cè)定的指標(biāo)除PO2外，還觀察了低氧溶液的pH值、PCO2和Na+滲透壓，保證了肺血管處于一個(gè)穩(wěn)定的低氧性環(huán)境。此外，本方法造價(jià)低廉，制作簡(jiǎn)單，使用方便，為低氧實(shí)驗(yàn)的研究提供了一種新手段。

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