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    CADM1過表達(dá)對(duì)人胃癌MKN-45細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其分子機(jī)制*

    2012-11-07 06:02:36郭曉鶴張彩鳳夏永華李貞娟周慧聰
    中國(guó)病理生理雜志 2012年12期
    關(guān)鍵詞:真核細(xì)胞株分化

    郭曉鶴, 張彩鳳△, 夏永華, 李貞娟, 周慧聰, 韓 宇

    (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1消化科,2皮膚科,河南 新鄉(xiāng)453100)

    細(xì)胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1,CADM1),稱為肺癌腫瘤抑制物1(tumor suppressor in lung cancer 1,TSLC1),已經(jīng)在非小細(xì)胞肺癌中被鑒定,其基因定位于人類染色體11q23.2[1-2]。CADM1 基因編碼 442 個(gè)氨基酸,屬于免疫球蛋白超家族,結(jié)構(gòu)上與神經(jīng)細(xì)胞黏附分子具有高度的同源性,主要牽涉到鈣離子非依賴的細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3-4]。最近,大量研究顯示,CADM1在一系列人類腫瘤組織和細(xì)胞系中呈低表達(dá)或缺失,包括食管癌[5]、宮頸癌[6]、肝癌[7]、卵巢癌[8]、乳腺癌等[9],然而在胃癌中尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。因此在本研究中,我們分析不同胃癌細(xì)胞系中CADM1蛋白的表達(dá),并構(gòu)建pcDNA-CADM1真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞并篩選和鑒定穩(wěn)定細(xì)胞株,接著研究CADM1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲的影響,并初步研究其可能的分子機(jī)制,該研究旨在為以CADM1為靶點(diǎn)的胃癌基因治療提供理論依據(jù)。

    材料和方法

    1 材料

    人胃癌細(xì)胞MKN-28(高分化)、SGC-7901(中分化)和MKN-45(低分化)均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)載體、脂質(zhì)體2000和Trizol試劑均購(gòu)自Invitrogen;PCR Mix購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I以及細(xì)胞裂解液均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;cDNA第1鏈合成試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;CCK-8試劑購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司;抗體CADM1、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶 2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、MMP-9和β-actin均購(gòu)自 Santa Cruz。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 胃癌細(xì)胞株MKN-28和SGC-7901均培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,MKN-45培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,細(xì)胞均置于37℃、5%CO2的孵箱中生長(zhǎng)。

    2.2 pcDNA-CADM1真核表達(dá)載體的構(gòu)建 從SGC-7901細(xì)胞中采用Trizol提取總RNA,然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以該cDNA為模板,CADM1上游引物 5’-CCGGAATTCATGGCGAGTGTAGTGCTGCC-3’(EcoR I)下游引物 5’-CCGCTCGAGCTAGATGAAGTACTCTTTC-3'(Xho I),產(chǎn)物大小1 329 bp。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性10 min,然后94℃ 40 s,56℃ 1 min,72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸6 min。接著將CADM1片段和載體均分別采用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切,然后在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接,接著轉(zhuǎn)化、挑克隆、提質(zhì)粒,酶切鑒定。

    2.3 pcDNA3.1和 pcDNA-CADM1轉(zhuǎn)染 當(dāng) MKN-45細(xì)胞達(dá)到90%左右融合時(shí),利用脂質(zhì)體2000將pcDNA3.1和pcDNA-CADM1轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞,細(xì)胞分為3組:未處理組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的MKN-45細(xì)胞)、pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的MKN-45細(xì)胞)和pcDNA-CADM1組(轉(zhuǎn)染pcDNA-CADM1的MKN-45細(xì)胞),轉(zhuǎn)染后采用600 mg/L G418進(jìn)行篩選,當(dāng)出現(xiàn)明顯的克隆后,對(duì)照細(xì)胞全部死亡時(shí)進(jìn)行傳代直至獲得穩(wěn)定細(xì)胞株,最后采用400 mg/L的G418維持培養(yǎng)。

    2.4 細(xì)胞增殖分析 3組MKN-45細(xì)胞分別在96孔板上接種 1 000 cells/well,測(cè)定其培養(yǎng) 0、24、48、72、96 及 120 h 時(shí)的增殖情況,每個(gè)樣品接種5個(gè)復(fù)孔,在測(cè)定細(xì)胞增殖時(shí),加入10%CCK-8試劑,于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h,然后于酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm的吸光度。

    2.5 Boyden chamber體外侵襲能力的檢測(cè) 將3組MKN-45細(xì)胞分別培養(yǎng)至大約105個(gè)細(xì)胞時(shí),分別懸浮在含有0.2%胎牛血清的800 μL培養(yǎng)液中,然后依次接種至Boyden chamber的上層,培養(yǎng)6 h。收集遷移到濾膜下層的細(xì)胞,用甲醇固定,并通過HE染色觀察下層細(xì)胞的數(shù)量,最后通過計(jì)算濾膜下層的細(xì)胞數(shù)來評(píng)估其轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)量(30個(gè)視野,×200)。

    2.6 Western blotting 收集 MKN -28、SGC-7901和 MKN-45細(xì)胞以及不同處理的MKN-45細(xì)胞,采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白,接著進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST液封閉 NC 膜 2 h,加入Ⅰ抗(CADM1、p21、MMP-2、MMP-9和β-actin,均1∶200),4℃ 搖床孵育過夜。加入Ⅱ抗室溫孵育2 h。將NC膜置于ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑)中反應(yīng)1~3 min,于暗室中利用X射線曝光,常規(guī)方法顯影定影,顯示特異的蛋白信號(hào)。蛋白表達(dá)的灰度值利用Image-Pro Plus 5.0軟件進(jìn)行分析,蛋白相對(duì)表達(dá)為目的基因與內(nèi)參基因的比值,β-actin作為內(nèi)參照。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 13.0軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,3組之間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 3種胃癌細(xì)胞株中CADM1蛋白的表達(dá)

    Western blotting結(jié)果顯示,低分化的MKN-45細(xì)胞中CADM1蛋白的表達(dá)水平明顯低于中分化的SGC-7901細(xì)胞和高分化的MKN-28細(xì)胞(P<0.05),而中分化的SGC-7901細(xì)胞中CADM1蛋白的表達(dá)水平與高分化的MKN-28細(xì)胞之間無顯著差異(P>0.05),見圖1,因此在下面的實(shí)驗(yàn)中采用CADM1蛋白表達(dá)水平最低的MKN-45進(jìn)行研究。

    Figure 1.Expression of CADM1 protein in three gastric carcinoma cell lines.ˉx±s.n=3.*P<0.05 vs MKN-28 or SGC -7901 cells.圖1 3種胃癌細(xì)胞株中CADM1蛋白的表達(dá)

    2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)CADM1細(xì)胞株的鑒定

    采用PCR擴(kuò)增CADM1基因,結(jié)果表明,CADM1全長(zhǎng)cDNA片段被成功獲得,見圖2A。我們進(jìn)一步將片段和pcDNA3.1空載體均采用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切,連接,轉(zhuǎn)化,挑克隆、提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定,酶切結(jié)果表明獲得了預(yù)期的載體帶和目的條帶,表明真核表達(dá)載體pcDNACADM1成功構(gòu)建,見圖2B。將所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA-CADM1和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞,獲取穩(wěn)定細(xì)胞株后,采用 Western blotting進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明pcDNA-CADM1組中CADM1蛋白表達(dá)顯著高于pcDNA3.1組和未處理組(P<0.05),而未處理組和pcDNA3.1組之間CADM1蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05),見圖3。

    Figure 2.Construction of eukaryotic expression vector pcDNACADM1.A:PCR amplication of CADM1 gene.1:PCR product;M:GeneRuler DNA Ladder Mix.B:identification of eukaryotic expression vector pcDNACADM1.1:pcDNA -CADM1 digested with double enzymes EcoR I and Xho I;M:GeneRuler DNA Ladder Mix.圖2 pcDNA-CADM1真核表達(dá)載體的構(gòu)建

    Figure 3.Identification of MKN-45 cells stably overexpressing CADM1.圖3 過表達(dá)CADM1的MKN-45穩(wěn)定細(xì)胞株的鑒定

    3 CADM1過表達(dá)抑制MKN-45細(xì)胞的增殖

    與未處理組和pcDNA3.1組相比,pcDNA-CADM1組在培養(yǎng)后的各時(shí)點(diǎn),MKN-45細(xì)胞的增殖均明顯受到抑制,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);未處理組和pcDNA3.1組在培養(yǎng)的各時(shí)點(diǎn),MKN-45細(xì)胞的增殖無顯著差異(P>0.05),見圖4。

    Figure 4.Effect of overexpression of CADM1 on proliferation of MKN-45 cells.ˉx±s.n=3.*P<0.05 vs non-treatment or pcDNA3.1.圖4 CADM1過表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖的影響

    4 CADM1過表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞侵襲的影響

    與未處理組(101.53 ±6.89)和 pcDNA3.1 組(98.77 ±7.03)相比,pcDNA-CADM1組中MKN-45細(xì)胞穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)(52.35±3.89)顯著減少(P<0.05),未處理組和pcDNA3.1組中MKN-45細(xì)胞穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

    5 CADM1過表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞中增殖和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    與未處理組和pcDNA3.1組相比,pcDNA-CADM1組中p21蛋白表達(dá)顯著升高,而MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而未處理組和pcDNA3.1組中上述各蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05),見圖5。

    討 論

    越來越多的研究表明,CADM1在多種不同腫瘤中均作為腫瘤抑制物而發(fā)揮作用[6,9-13]。目前在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)CADM1表達(dá)的缺失或降低,并證實(shí)其牽涉到許多腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[2,14-16]。Takahashi等[17]研究表明,67 例原發(fā)性乳腺癌中具有異常的CADM1表達(dá)。Chen等[18]發(fā)現(xiàn)8個(gè)結(jié)腸癌中有7個(gè)出現(xiàn)CADM1的低表達(dá),而54例原發(fā)性結(jié)腸癌中有39例出現(xiàn)CADM1的低表達(dá)。本研究中,我們選擇3種分化程度不同的胃癌細(xì)胞株,利用Western blotting檢測(cè)3種細(xì)胞中CADM1蛋白的表達(dá),結(jié)果表明,3種胃癌細(xì)胞中均明顯出現(xiàn)CADM1蛋白表達(dá),隨著分化程度降低,CADM1蛋白表達(dá)水平也顯著下調(diào),即低分化的MKN-45細(xì)胞中CADM1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于中分化的SGC-7901細(xì)胞和高分化的MKN-28細(xì)胞,提示CADM1的表達(dá)與胃癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

    Figure 5.Expression of p21,MMP-2 and MMP-9 proteins in MKN-45 cells with different treatments.ˉx±s.n=3.*P <0.05 vs non -treatment or pcDNA3.1.圖5 p21、MMP-2和MMP-9在不同處理的MKN-45細(xì)胞中的表達(dá)

    為了進(jìn)一步研究CADM1在胃癌細(xì)胞中的功能,我們構(gòu)建CADM1的真核表達(dá)載體 pcDNA-CADM1,將其轉(zhuǎn)染到CADM1表達(dá)水平最低的MKN-45細(xì)胞株中,篩選穩(wěn)定表達(dá)CADM1的胃癌細(xì)胞株,進(jìn)一步采用Western blotting鑒定,結(jié)果顯示,篩選到的穩(wěn)定表達(dá)CADM1的MKN-45細(xì)胞中其CADM1蛋白表達(dá)水平顯著高于未處理組和pcDNA3.1組(P<0.05),提示pcDNA-CADM1真核表達(dá)載體的引入能明顯上調(diào)MKN-45細(xì)胞中CADM1蛋白表達(dá)水平,這也為后續(xù)進(jìn)一步研究CADM1的功能提供理想的研究平臺(tái)。

    研究顯示,CADM1是細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵調(diào)控因子[19-20]。Mao等[21]研究發(fā)現(xiàn) CADM1 過表達(dá)可抑制A549 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并抑制A549皮下接種的腫瘤至70% ~80%的程度。此外,Lung等[11]的研究表明CADM1在有轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)或缺失的頻率為83%,顯著高于原發(fā)性鼻咽癌的12%(P<0.05),提示CADM1與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。是否上調(diào)胃癌MKN-45細(xì)胞中CADM1蛋白的表達(dá)能改變胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力?因此,在本研究中,我們采用CCK-8研究3組MKN-45細(xì)胞中細(xì)胞增殖的變化,結(jié)果顯示與未處理組和pcDNA3.1組相比,pcDNACADM1組在培養(yǎng)后的各時(shí)點(diǎn),MKN-45細(xì)胞的增殖均明顯受到抑制(P<0.05)。此外,我們還利用Boyden小室體外遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組胃癌細(xì)胞的遷移能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDNACADM1組中MKN-45細(xì)胞遷移到matrigel的細(xì)胞數(shù)明顯低于未處理組和pcDNA3.1組(P<0.05),上述研究結(jié)果提示CADM1的過表達(dá)能明顯抑制胃癌MKN-45細(xì)胞的增殖和降低其遷移能力,但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

    研究表明,p21與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān),其在腫瘤細(xì)胞中能明顯傳遞抗增殖信號(hào)[22]。而2種主要的金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2和MMP-9與許多腫瘤的惡性程度有關(guān),主要由于其獨(dú)特的降解IV型膠原能力,這也是基底膜的主要構(gòu)成成份[23],提示其表達(dá)水平的高低與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。因此,為了初步了解CADM1介導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖抑制和侵襲能力降低的可能分子機(jī)制,我們采用Western blotting分析了3組MKN-45胃癌細(xì)胞中p21、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)pcDNA-CADM1組中p21蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),而MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05),表明CADM1介導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖抑制和侵襲能力降低可能與p21蛋白表達(dá)水平的升高以及MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的降低密切相關(guān)。

    總之,本研究結(jié)果顯示,CADM1的過表達(dá)能明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,其變化可能與p21、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的變化密切相關(guān)。進(jìn)一步研究CADM1在胃癌中的功能有望為以CADM1為靶點(diǎn)的胃癌基因治療提供理論依據(jù)。

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