SLP－2 在胃癌組織中的表達及其預后意義*

顏淑梅， 吳秋良△， 奚少彥， 梁建中， 張 玉， 馮沿芬，侯景輝， 盧佳斌， 黃春雨， 杜紫明， 周志偉

(1華南腫瘤學國家重點實驗室，中山大學腫瘤防治中心2病理科，3胃胰科，廣東 廣州510060)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。盡管胃癌在以手術為主的綜合治療方面取得了許多進展，但是5 年生存率仍然徘徊在30%～40 %左右，此現(xiàn)狀促使學者們對胃癌的發(fā)病機理及預后做多方面、多層次的研究。紅細胞膜整合蛋白SLP-2(stomatin -like protein 2)是stomatin 家族的新成員之一［1］，SLP-2 或其它整合蛋白與周邊組織細胞骨架聯(lián)合起來，參與了離子通道轉(zhuǎn)導、鞘脂類的組織以及膽固醇豐富的脂質(zhì)筏的調(diào)控，影響細胞的黏附功能，從而成為腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素之一。近年來發(fā)現(xiàn)SLP -2 作為一種細胞膜與線粒體內(nèi)膜相關蛋白，可能參與了對細胞凋亡和細胞周期的調(diào)控，也可能在癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用［2］。Zhang 等［3］首次發(fā)現(xiàn)SLP -2基因在食管鱗狀細胞癌中過表達，并與腫瘤的發(fā)生﹑發(fā)展關系密切。Jinawath 等［4］采用cDNA 微陣列的方法，發(fā)現(xiàn)stomatin 基因在彌散型胃癌中表達上調(diào)。張劍等［5］最近發(fā)現(xiàn)SLP -2 在胃腺癌組織中呈高表達，并與胃腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期相關，但未研究與預后的關系。本實驗采用免疫組化方法檢測了胃癌組織SLP-2 蛋白表達，探討其在病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲程度、預后等臨床特征方面的意義。

本研究采用兔抗SLP-2 多克隆抗體，應用免疫組化兩步法，研究SLP -2 基因的表達產(chǎn)物即SLP -2 蛋白在胃癌組織內(nèi)定位、分布及SLP -2 蛋白表達與胃癌臨床病理的關系，探討其在胃癌發(fā)生、發(fā)展、入侵和轉(zhuǎn)移中的重要作用，為胃癌的診斷、監(jiān)測和治療提供重要理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

數(shù)據(jù)源于中山大學腫瘤防治中心數(shù)據(jù)庫，剔除伴嚴重基礎疾病的病例。選取2005 年4 月至2006年12 月胃癌手術切除標本190 例，男性130 例，女性60 例，年齡最大82 歲，最小20 歲，中位年齡58 歲。術前術后均未行化療和放療。按2010 年TNM 分期標準分期，其中I 期23 例，II 期42 例，III 期100 例，IV 期25 例。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者140 例，陰性者50 例。病理分化程度:高/中分化腺癌69 例，低分化腺癌(包括印戒細胞癌和黏液腺癌)121 例。所有病例都有完整的臨床資料及石蠟標本。所有活檢標本均用10%中性甲醇液固定，切片HE 染色，由臨床病理高年資醫(yī)生閱片作出病理診斷。

2 方法

10%甲醇固定標本，石蠟包埋，切成4 μm 厚切片。采用鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SP)法(SP 試劑盒邁新公司產(chǎn)品)，石蠟切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后用微波檸檬酸鈉修復20 min，用過氧化物酶阻斷劑(A 試劑)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，正常動物血清(B 試劑)封閉非特異性抗體，滴加1∶200 兔抗人SLP-2 多克隆抗體(Proteintech Group Inc)，4 ℃過夜。次日滴加生物素標記的第Ⅱ抗體(C 試劑)、鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶溶液(D 試劑)、新鮮配制的3，3 -二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水、中性樹膠封固。已知陽性胃癌切片作為陽性對照，PBS 緩沖液代替Ⅰ抗作為陰性對照。

3 SLP2 蛋白免疫組化的評分標準

組織切片中顯示胞質(zhì)為淡黃色或棕黃色者為陽性細胞標志，SLP-2 蛋白定位于細胞質(zhì)，凡顯色強度與背景無差異者為陰性，而顯色強度高于背景的為陽性表達。按照Song 等［6］SLP -2 免疫反應計分標準，將SLP-2 的表達染色強度得分與陽性細胞比例得分相乘。其中強度評分標準:1 分為陰性，2 分為弱陽性，3 分為中等陽性，4 分為強陽性;而陽性細胞比例分為:0 分為無陽性細胞，1 分為≤10%的陽性細胞，2 分為11% ～50%的陽性細胞，3 分為51% ～75%的陽性細胞，4 分為＞75%的陽性細胞。由2 位病理醫(yī)生獨立閱片，取其平均值。SLP2 表達陽性的標準為得分＞8 分。

4 隨訪

本組采用書信或電郵、電話與門診復診隨訪。隨訪起點時間為行胃癌手術當天，隨訪至2011 年9月26 日(2 ～76.5 個月，中位隨訪40.5 個月)。隨訪終點為死亡日期。

5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0 軟件，對SLP -2 蛋白的陽性率與臨床病理參數(shù)、預后之間的關系用χ2檢驗。累積生存率根據(jù)壽命表法計算，生存曲線用Kaplan -Meier 法分析，單因素生存分析用log -rank 檢驗，用Cox 回歸進行多因素分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 SLP－2 在胃癌組織中的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系

SLP-2 蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜中的表達情況見圖1。SLP 蛋白在胃癌組織細胞漿和細胞膜中呈棕褐色粗顆粒狀，正常黏膜陰性或者弱陽性。SLP-2 蛋白在胃癌組織中表達的陽性率為63.2%(120/190)。SLP-2 蛋白的陽性率與胃癌浸潤深度(P ＜0.01)、TNM 分期(P ＜0.01)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.05)有關，而與性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤直徑及遠處轉(zhuǎn)移均無關，見表1。

2 胃癌預后影響因素的單因素和多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示:不同TNM 分期(P ＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P ＜0.01)、遠處轉(zhuǎn)移(P ＜0.01)、腫瘤直徑(P ＜0.01)、分化程度(P ＜0.05)、癌組織浸潤深度(P ＜0.01)和SLP-2 表達情況患者生存期均有顯著差異。單因素分析中，將SLP-2 表達陰性患者的死亡風險比設定為1，SLP -2 陽性患者的死亡風險比為2.23(95%CI:1.29 ～3.85，P ＜0.01)。從單變量分析中找到顯著影響預后的各指標，經(jīng)Cox 比例風險模型多因素分析顯示，僅有TNM分期和腫瘤直徑是顯著獨立的預后指標(P ＜0.05，P＜0.01)，見表2。

3 SLP－2 表達與術后生存率的關系(Kaplan－Meier 生存分析)

SLP-2 陰性表達者生存率曲線始終在其陽性表達者之上，隨時間延長，生存率下降緩慢。5 年累計生存率SLP-2 陰性表達明顯高于陽性表達(P ＜0.01)，見圖2。

表1 SLP－2 蛋白表達與臨床病理參數(shù)之間的關系Table 1. Relationship between expression of SLP-2 protein and clinicopathological characteristics

表2 影響190 例胃癌患者預后的臨床病理變量的單因素和多因素分析Table 2. Univariate and multivariate survival analysis of clinicopathological variables in 190 cases of gastric carcinoma patients

Figure 2. Kaplan - Meier survival curves of gastric cancer patients after gastrectomy. The survival rate of the patients in SLP - 2 - positive group was significantly lower than that of the patients in SLP -2 - negative group (log-rank test，P ＜0.01).圖2 術后胃癌患者的生存曲線

討 論

胃癌具有早期癥狀不明顯、復發(fā)率高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早等特點，胃癌的病死率一直居高不下。然而，目前雖然有許多分子證實參與了胃癌的多種惡性表型，比如HER -2、VEGF、EGFR 等，但其在判斷預后方面的價值一直存在著爭議。因此，尋找新的與胃癌發(fā)生發(fā)展以及患者生存時間有關的生物學指標有重要的臨床意義。

SLP-2 基因是2000 年首次發(fā)現(xiàn)并命名的一個新基因，其表達產(chǎn)物在當時被鑒定為細胞膜相關蛋白［1］。SLP-2 是stomatin 基因超家族的一員，定位于染色體9p13.1［7］，其編碼的SLP-2 蛋白在人體組織中分布廣泛，其中在骨骼肌和心臟中的表達水平較高。有研究推測，該蛋白也出現(xiàn)在成熟紅細胞膜中，并且與血影蛋白-肌動蛋白細胞骨架相結(jié)合，或與其它整合膜蛋白結(jié)合，但其本身并不整合到膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中，可能作為外周膜蛋白起作用，從而將stomatin 或其它整合膜蛋白與細胞骨架聯(lián)系起來，調(diào)控離子通道的轉(zhuǎn)導、鞘脂和富含膽固醇的脂筏組織［7-8］。近年來關于線粒體的蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)，SLP-2 存在于細胞的線粒體中［9］，并與一些線粒體內(nèi)膜相關蛋白有直接結(jié)合，可能參與調(diào)節(jié)與其結(jié)合的線粒體膜相關蛋白的穩(wěn)定性［2，10］。

SLP-2 在人的多種組織中如腦、肺、胸腺、氣管、食管黏膜、胃、心臟、結(jié)腸、小腸、腎臟、肌肉等中廣泛表達［11］。多項研究表明，SLP-2 在惡性腫瘤中表達明顯上調(diào)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有重要作用。Zhang 等［3］首次發(fā)現(xiàn)SLP-2 在食管鱗癌組織中表達上調(diào)，表達水平是正常食管黏膜的6 倍以上，其反義核酸可抑制腫瘤細胞的生長和增殖，使裸鼠致瘤能力大大降低。Cao 等［12-13］發(fā)現(xiàn)SLP -2 在喉鱗癌、乳腺癌中高表達，與預后相關。此后的一些研究表明，SLP - 2 在肺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌［6，12，14-18］等惡性腫瘤中也存在高表達。推測其在惡性腫瘤中的高表達是一個較為普遍的現(xiàn)象，SLP-2 可能是一個新的癌基因. 但目前關于SLP -2 基因的研究較少，其分子機制相關的研究更少。Song等［6］通過基因敲除技術，發(fā)現(xiàn)經(jīng)SLP -2 基因敲除的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力下降，其分子機制可能是抑制了NF - κB/MMP -9 轉(zhuǎn)導通路。張劍等［5］最近發(fā)現(xiàn)SLP-2 在胃腺癌組織中呈高表達，并與胃腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期相關。

本實驗采用免疫組織化學法檢測190 例胃腺癌組織中SLP-2 蛋白表達水平，結(jié)果顯示，SLP-2 蛋白陽性率為63.2%(120/190)。結(jié)合免疫組織化學結(jié)果和患者臨床病理資料進行分析發(fā)現(xiàn)，SLP -2 蛋白的高表達與胃癌浸潤深度、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P ＜0.05)，即較晚期病例的胃腺癌組織SLP-2 蛋白的表達水平高于較早期病例的胃腺癌組織，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例相對應的胃腺癌組織中SLP-2蛋白的表達水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，癌組織浸潤超出肌層的病例相對應的胃腺癌組織中SLP-2蛋白的表達水平高于癌組織浸潤局限于肌層內(nèi)的病例;而SLP-2 蛋白的表達與其它臨床病理參數(shù)沒有顯著相關性。提示SLP -2 可能是一個與胃腺癌分期和轉(zhuǎn)移相關的指標，在胃腺癌的發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移中起一定的促進作用。臨床資料進一步顯示:SLP -2 陽性表達患者5 年生存率明顯低于其陰性表達者，Kaplan-Meier 顯示SLP-2 陰性表達者5 年累積生存率高于陽性表達者，說明SLP-2 在一定程度上促進腫瘤的生長，其表達提示胃癌預后相對較差。

本研究發(fā)現(xiàn)SLP-2 在胃腺癌組織中呈高表達，并與胃腺癌的胃癌浸潤深度、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。從Cox 比例風險模型單、多因素分析可見:只有腫瘤直徑和TNM 分期是顯著獨立的預后指標，SLP-2 雖不是獨立的預后因素，但它與影響胃癌預后因素存在相互關聯(lián)，其過度表達在一定程度上能影響胃癌的預后。這提示SLP -2 表達不僅參與了胃癌的發(fā)生，而且與腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移有關;其基因產(chǎn)物陽性表達的胃癌患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。然而SLP-2 參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機制尚不清楚。Christie 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，SLP -2 可能通過調(diào)節(jié)線粒體膜磷脂濃度，使得線粒體膜離子通道復合物順利組裝合成，包括復合物I、II，從而增加細胞的ATP 儲備。通過Song 等［6］的研究結(jié)果，我們可以推測SLP-2 可能通過影響MMP -9 蛋白的表達來干擾NF-κB/MMP -9 轉(zhuǎn)導通路，從而影響腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。因此，SLP-2 可能作為胃癌的一個有意義的預后指標，指導胃癌患者的預后生存，并有可能作為一個新的腫瘤靶向治療的靶點，但對其具體功能及機制，有待我們更深入地研究。

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