“漸處理”對肺缺血再灌注損傷的保護作用

麻日虎 李 瑩 王玉旋 張 靜

1.廣東省深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院外科，廣東深圳 518172；2.山西省腫瘤醫(yī)院胸外科，山西太原 030013

缺血/再灌注損傷主要發(fā)生在再灌注的初期，與長時間缺血后突然再灌注引起細胞呼吸爆發(fā)、氧自由基的堆積、Ca2+超載等有關。多年來，針對如何進行再灌注干預一直是減輕缺血器官損傷研究的熱點[1]?！皾u處理”也稱逐漸、溫和或階段性再灌注，是指缺血再灌注時從零開始逐漸增加血流到不加以控制。研究證實，緩慢地再灌注可以減輕缺血再灌注損傷[2-4]?！皾u處理”作為一種改良的缺血后處理方式，不需要預知缺血事件發(fā)生的時間，又沒有繁瑣的再灌注/缺血循環(huán)操作，不附加額外的缺血，可能有更廣闊的臨床應用前景。本實驗擬通過建立大鼠在體肺缺血再灌注模型，探討“漸處理”對肺缺血再灌注損傷的作用及機制，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

健康雄性SD大鼠40只，體重250～350 g，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供。參附注射液由雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字Z51020664。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒均購置于南京建成生物工程公司；細胞凋亡檢測試劑盒購置于武漢博士德生物工程公司。

1.2 動物模型制備

參照Eppinger等[5]大鼠肺缺血再灌注損傷模型加以改進，健康大鼠以戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，尾靜脈注射肝素。氣管切開后進行氣管插管，小動物呼吸機輔助通氣。胸骨右緣第四肋間開胸，于吸氣末用無創(chuàng)血管夾阻斷右肺門包括右主支氣管和右肺動靜脈 （以肺無舒縮為阻斷標準）。并應用溫熱的37℃生理鹽水棉紗敷蓋創(chuàng)口。缺血的時間為45min，為缺血期。45min后放開結扎線，使肺臟充盈后，計時120 min，為再灌注期。再灌注期結束后左房放血處死大鼠。

1.3 動物分組及處理

40只大鼠隨機分成四組，每組10只。手術對照組（S組）：僅解剖，不阻斷右肺門持續(xù)灌注165min；缺血再灌注組（I/R組）：在吸氣末用無創(chuàng)傷血管夾阻斷右肺門，45min后開放再灌注120min；缺血后處理組（IPO組）：阻斷右側肺門45min后，短暫再灌注10 s，缺血10 s，反復5次，然后再全面恢復灌注120 min；缺血后漸處理組（IGR組）：阻斷右側肺門45min后，逐步恢復再灌注血流，50%1 min，80%2 min，然后再全面恢復灌注120 min。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 肺組織濕干重比（W/D）用濾紙吸去右肺上葉血，分析天平稱重為濕重，置于70℃電熱恒溫干燥箱中烤至恒重，稱重為干重，計算肺W/D比值。

1.4.2 病理檢查取約1 cm×1 cm×1 cm新鮮右肺組織，沾去表面血跡，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色后光學顯微鏡觀察。

1.4.3 肺組織MDA、SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法測血漿SOD活性；硫代巴比妥酸法測MDA活性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行資料錄入、整理及統(tǒng)計分析處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采采用單因素方差分析和t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠肺組織濕干比比較

I/R組、IPO組及IGR組大鼠肺組織W/D明顯高于S組（P＜0.01）。IPO組及IGR組大鼠肺組織W/D值明顯低于I/R組（P＜0.01）。IPO組及IGR組大鼠肺組織W/D比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 四組大鼠肺組織濕干比比較（±s）

表1 四組大鼠肺組織濕干比比較（±s）

注：與S組比較，**P＜0.01；與I/R組比較，##P＜0.01

組別只數(shù) W/D S組I/R組IPO組IGR組10 10 10 10 4.96±0.13 6.40±0.25**5.48±0.20**##5.28±0.25**##

2.2 四組大鼠肺組織病理變化

光鏡下S組肺泡腔內(nèi)無水腫、出血及壞死，間隔無增寬，無炎癥細胞浸潤，結構清晰可見；I/R組肺泡腔內(nèi)明顯出血、水腫、血管擴張、炎性細胞浸潤明顯，并有局灶性肺氣腫，肺泡間隔增寬，偶見局灶性壞死，組織細胞結構紊亂；與I/R組比較，IPO組及IGR組肺組織水腫、出血、炎性細胞浸潤等明顯減輕。

2.3 四組大鼠肺組織勻漿中SOD活力及MDA水平比較

與S組大鼠比較，I/R組、IPO組及IGR組大鼠肺組織勻漿中SOD活力明顯降低，MDA水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05、P＜0.01）；與 I/R 組大鼠比較，IPO 組及 IGR組大鼠肺組織勻漿中SOD活力明顯升高，MDA水平明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；IPO組大鼠肺組織勻漿中SOD活力明顯低于IGR組（P＜0.05），兩組MDA水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 四組大鼠肺組織勻漿中SOD活力及MDA水平比較（±s）

表2 四組大鼠肺組織勻漿中SOD活力及MDA水平比較（±s）

注：與 S組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與 I/R 組比較，##P ＜0.01；與 IPO組比較，△P＜0.05

組別只數(shù) MDA（nmoL/mg） SOD（U/mg）S組I/R組IPO組IGR組10 10 10 10 42.13±3.40 69.63±7.03**53.28±4.46**##48.58±4.29*##120.40±13.03 63.80±5.19**81.50±8.21**##94.46±12.67**##△

3 討論

人們已越來越認識到再灌注是一把“雙刃劍”，一方面使缺血組織細胞重獲血供，挽救了缺血組織損傷，另一方面它產(chǎn)生大量活性氧類和Ca2+超載等，會導致比單純?nèi)毖鼮閲乐氐膿p傷，即所謂的缺血再灌注損傷[6]。近年來，對如何減輕并防止再灌注損傷進行了廣泛的研究，包括缺血前的預處理和缺血后處理[7]。缺血后處理不需要預知缺血事件發(fā)生的時間，更具有操作性和臨床價值，因此成為目前研究的熱點，并已在不同動物的不同器官證明了缺血后處理對缺血/再灌注器官的保護作用。目前有多種后處理方法應用于基礎和臨床研究中[8]。

研究證實，“漸處理”作為一種改良的后處理方式，和后處理一樣均促進再灌注后心功能的恢復，并降低再灌注后心肌損傷，且沒有繁瑣的再灌注/缺血循環(huán)操作，更易于臨床應用[2-3]。本研究應用動物試驗模型研究了“漸處理”對肺缺血再灌注損傷的影響及機制。肺毛細血管內(nèi)皮細胞受損是肺缺血再灌注損傷的特征性改變，主要表現(xiàn)為肺血管通透性和血管阻力增加、肺順應性降低，導致肺水腫。本實驗從細胞結構觀察，以及對肺組織含水量的檢測發(fā)現(xiàn)，I/R組肺W/D較S組顯著增加，表示肺組織微血管通透性增高，血管內(nèi)水分漏出增加，且光鏡下可見肺泡間隔變窄，炎性細胞浸潤及出血，呈典型的肺損傷形態(tài)學改變。IPO組及IGR組組織、細胞結構仍清晰，損傷程度較肺I/R組明顯減輕，肺W/D顯著降低，IPO組及IGR組無明顯差異。表明“漸處理”能夠減輕大鼠缺血再灌注肺損傷，其保護作用可能通過改善肺毛細血管的通透性、減輕肺的氧化應激反應、減少中性粒細胞的聚集等機制得以實現(xiàn)。

研究證實，肺缺血再灌注損傷的發(fā)病機制與氧自由基及脂質(zhì)過氧化反應有關[9]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，測定MDA可直接反映自由基水平，其含量高低是組織細胞損傷的重要標志。SOD是自由基的重要清除酶之一，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，因而SOD活性可反映機體對氧自由基清除能力的高低。本組實驗中，觀察了“漸處理”對脂質(zhì)過氧化損傷的保護作用。結果發(fā)現(xiàn)IGR組，SOD活力明顯高于I/R組及IPO組，而MDA水平明顯低于I/R組；表明“漸處理”具有清除超氧化物陰離子自由基、減輕脂質(zhì)過氧化損傷、保護細胞的作用，從而保護缺血/再灌注過程中的肺組織細胞，減輕了缺血及再灌注的損傷作用。

實驗結果證明，經(jīng)典缺血后處理及“漸處理”對缺血再灌注損傷肺組織均有保護作用?！皾u處理”作為一種改良的后處理方式，由于沒有繁瑣的再灌注/缺血循環(huán)操作，以及對缺血器官“二次缺血”的打擊，是一種更有效的、更適合臨床應用的、減輕再灌注損傷的方法。

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