阿司匹林或氯吡格雷作用下血小板不同活化途徑的反應(yīng)特點(diǎn)

李健 曹劍 王成彬 王華忠 賈冠洲 莫亞明 叢玉隆

·臨床研究·

阿司匹林或氯吡格雷作用下血小板不同活化途徑的反應(yīng)特點(diǎn)

李健 曹劍 王成彬 王華忠 賈冠洲 莫亞明 叢玉隆

目的探討阿司匹林和氯吡格雷抑制血小板環(huán)氧酶(COX)-1途徑和P2Y12受體活化的特點(diǎn)及兩途徑之間的交互關(guān)系。方法20例健康男性志愿者按隨機(jī)數(shù)余數(shù)分組法平均分為兩組，分別服用阿司匹林(100mg/d)和氯吡格雷(75mg/d)連續(xù)7 d。并在服藥和停藥后第1、3、5、7天分別應(yīng)用血栓彈力圖、血小板功能分析儀和流式細(xì)胞儀觀察血小板的抑制情況。結(jié)果服藥后，氯吡格雷組的膠原-腎上腺素激活的閉孔時(shí)間(CEPI-CT)和膠原-腺苷二磷酸閉孔時(shí)間(CADP-CT)的變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.2，P＜0.01，F(xiàn)=25.3，P＜0.05)，阿司匹林組CEPI-CT迅速增至檢測上限300 s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.7，P＜0.01)，而CADP-CT變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.12，P= 0.13)。服藥后阿司匹林組血小板COX-1途徑抑制率增高至91.7%±0.9%(F=35.1，P＜0.01)，氯吡格雷組P2Y12受體抑制率由47.8%±3.1%增高至81.3%±3.8%(F=24.8，P＜0.01)，COX-1未受到有效抑制(F=1.85，P=0.11)。服藥后兩組CD62p表達(dá)降低50%(氯吡格雷組:F=28.7，P＜0.01;阿司匹林組:F=20.7，P=0.02)。結(jié)論花生四烯酸誘導(dǎo)的COX-1途徑活化與P2Y12受體活化可能存在交互作用，床旁即時(shí)檢驗(yàn)有助于快速了解血小板功能狀態(tài)，為監(jiān)測有效的聯(lián)合用藥提供依據(jù)。

血小板;阿司匹林;氯吡格雷;即時(shí)檢驗(yàn)

血小板活化作為血栓形成中主要的始動因素在正常止血和病理凝血過程中發(fā)揮著重要作用，抗血小板藥物的應(yīng)用也日益成為預(yù)防心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病和介入治療的焦點(diǎn);特別是所謂“藥物抵抗”現(xiàn)象受到廣泛關(guān)注以來，血小板功能監(jiān)測備受矚目。為此，本研究應(yīng)用床旁即時(shí)檢驗(yàn)系統(tǒng)血小板功能分析儀PFA-100和血栓彈力圖兩種新方法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，對健康個(gè)體進(jìn)行阿司匹林和氯吡格雷作用下的血小板功能分析，以期發(fā)現(xiàn)花生四烯酸(AA)誘導(dǎo)的環(huán)氧酶(COX)-1途徑和二磷酸腺苷(ADP)活化的P2Y12受體受抑制的反應(yīng)特征。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本院醫(yī)生和工勤人員20名，入選標(biāo)準(zhǔn):健康成年男性志愿者年齡23～39歲，平均(31.0±5.3)歲，紅細(xì)胞壓積在30%～50%之間，血小板計(jì)數(shù)(100～300)×109/L，C反應(yīng)蛋白(CRP)＜8 mg/L。排除標(biāo)準(zhǔn):出血性疾病史;消化道潰瘍病史;既往嚴(yán)重高血壓史(收縮壓200 mm Hg或舒張壓≥120 mm Hg);妊娠期婦女，高度懷疑主動脈夾層或動脈瘤，肝腎功能障礙;接受口服華法林抗凝治療。按隨機(jī)數(shù)余數(shù)分組法分為兩組，10例服用阿司匹林腸溶片(拜阿司匹林片，德國拜耳制藥，批號:BG04765)，連續(xù)7 d，100 mg/d，另外10例服用氯吡格雷片(波立維，法國賽諾菲安萬特，批號:1A500)，連續(xù)7 d，75 mg/d，每次均監(jiān)督服藥。分別在服藥前，服藥和停藥后第1、3、5、7天抽血送檢。除1例服用阿司匹林者有輕度牙齦出血外，未見其他不良反應(yīng)。本方案經(jīng)倫理審查批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。

1.2 方法

檢測當(dāng)天下午采集受試者靜脈血，使用內(nèi)含肝素鋰和0.109 mol/L枸櫞酸鈉(1∶9)的試管(BD公司，美國)抗凝，血小板功能分析在采血后3 h內(nèi)全部完成。

分別使用膠原-腎上腺素反應(yīng)杯(collagen/ epinephrine，記為CEPI)和膠原-腺苷二磷酸反應(yīng)杯(collagen/adenosine-diphosphate，CADP)在PFA-100 (DADE Berhing，德國)中檢測受試者抗凝標(biāo)本，記錄血小板黏附和聚集時(shí)堵塞微孔所需的時(shí)間(closure time，CT)。CEPI-CT和CADP-CT的參考范圍分別為(82～150)s和(62～100)s。

利用血栓彈力圖儀Thrombelastograph 5000 (TEG，Haemonetics公司，美國)分別測定最大振幅(maximum amplitude，MA)、纖維蛋白凝集力(MAA)、ADP和AA誘導(dǎo)的血小板凝集力(MAAA和MAADP)，從而計(jì)算出全血條件下AA或ADP途徑的抑制率{［1－(MA－MAAA/ADP)/(MA－MAA)］× 100%}。各主要指標(biāo)的參考范圍分別為反應(yīng)時(shí)間(R):2～8 min、加速時(shí)間(K):1～3 min、加速角(Angle):55～78度、MA:51～69 mm。

使用配套試劑在FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)上測定血小板活化標(biāo)志物CD62p的活性。

上述3種方法根據(jù)制造商建議和目前研究的通行辦法，使用未服抗血小板制劑的健康人血標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)控，通過后進(jìn)行測試。

為了消除炎癥反應(yīng)［1］和血液流變學(xué)對研究結(jié)果的影響，服藥前后分別測定了受試者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、CRP和全血黏度。WBC在XT-4000i血細(xì)胞分析儀(Sysmex公司，日本)上使用原廠配套試劑完成，CRP在BNⅡ特種蛋白分析儀(Siemens公司，德國)使用原廠hs-CRP試劑測定，全血黏度在SA-6000全自動血液流變分析儀(賽科希德公司，北京)上檢測。在1、5、30、200(S－1)四個(gè)切變率下男性全血黏度的參考區(qū)間(mPa·s)分別為:17.60～21.35、8.31～9.95、5.18～5.94和3.53～4.65，每天質(zhì)控通過后再行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，計(jì)數(shù)資料用百分構(gòu)成比表示。用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，組內(nèi)用藥前后WBC、CRP和全血黏度的比較用配對t檢驗(yàn)，組間比較計(jì)量指標(biāo)用方差分析，用一般線性模型(general linearity model)分析各時(shí)間點(diǎn)血小板抑制率或閉孔時(shí)間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血液學(xué)基本參數(shù)調(diào)查

受試對象的WBC、CRP和全血黏度在服藥前后的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

2.2 CEPI-CT和CADP-CT

阿司匹林組服藥3 d后，CEPI-CT全部超過檢測上限300 s，停藥第7天仍處于較高水平，CEPI-CT隨時(shí)間變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.7，P＜0.01);CADP-CT未超出參考區(qū)間，變化不顯著(F=2.12，P=0.13)(圖1)。

表1 受試前后各組WBC、CRP和血液黏度的比較(ˉx±s)

圖1 服用阿司匹林或氯吡格雷受試組CEPI-CT和CADP-CT的變化趨勢

2.3 AA和ADP誘導(dǎo)聚集受抑制的情況

阿司匹林組服藥后AA誘導(dǎo)聚集的抑制率增高至91.7%±0.9%，停藥后迅速下降至18.6%± 3.5%，變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.1，P＜0.01)。氯吡格雷組服藥后ADP誘導(dǎo)的聚集率由47.8%±3.1%增高至81.3%±3.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.8，P＜0.01)，AA誘導(dǎo)聚集的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.85，P=0.11)(圖2)。

圖2 服用阿司匹林和氯吡格雷受試組血小板抑制率的變化趨勢

2.4 CD62p的表達(dá)特征

服藥7 d后氯吡格雷組CD62p的表達(dá)由24%± 12%降至12%±8%(F=28.7，P＜0.01)，阿司匹林組則由22%±9%降至10%±2%(F=20.7，P= 0.02)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 兩受試組CD62p在服藥前后的變化

3 討論

大量前瞻性研究表明阿司匹林抑制血小板活性的實(shí)際療效需要監(jiān)測。光學(xué)法血小板聚集率檢測作為“金標(biāo)準(zhǔn)”受到諸多分析前影響因素(比如采血方法、抗凝劑種類、藥物干擾和難于標(biāo)準(zhǔn)化等)和方法學(xué)本身(血漿提取和血小板數(shù)目等)的限制，臨床應(yīng)用尚不充分。這些干擾的不可預(yù)知性使臨床迫切地需要更為理想、方便的檢測技術(shù)［2］。PFA-100，TEG，VerifyNow和Sonoclot等床旁型即時(shí)檢驗(yàn)設(shè)備的異軍突起，為血小板功能監(jiān)測和指導(dǎo)臨床治療帶來了新的曙光。

PFA-100血小板功能分析儀的閉孔時(shí)間綜合性地反映了包括聚集在內(nèi)的多種血小板功能［3］，患者服用阿司匹林時(shí)通常表現(xiàn)為CEPI-CT延長，而CADP-CT變化不大［4］。本研究發(fā)現(xiàn)CADP-CT在用藥和停藥后有小幅波動，提示其他途徑(如ADP活化)可能受到阿司匹林的間接影響。有學(xué)者認(rèn)為PFA-100對氯吡格雷等P2Y12受體拮抗劑的療效檢測似乎不很敏感，筆者認(rèn)為有必要從PFA-100的影響因素去理解:比如在高切變率條件下紅細(xì)胞比積和血液黏度的差異作用，膠原的參與受到vWF水平的影響以及血小板水平的高低等。由于血小板抑制與CRP的潛在相關(guān)性［5］，本研究也測定了WBC、CRP和全血黏度，從結(jié)果看，受試期間這些因素不足以形成對結(jié)論的影響。

阿司匹林組服藥后AA活化抑制率顯著增高，提示100 mg阿司匹林能夠有效抑制健康個(gè)體的COX-1活化，與PFA-100相似的是，TEG檢出的ADP活化抑制也出現(xiàn)小幅波動。由于血小板活化時(shí)伴隨著ADP的釋放，ADP繼而又激活血小板，所以存在著兩個(gè)途徑活化耦聯(lián)的可能性，兩者之間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。氯吡格雷組在服藥后存在COX-1抑制的減低趨勢，也提示這種關(guān)聯(lián)的存在;此外，也表明同時(shí)服用阿司匹林有利于有效抑制兩個(gè)主要的活化方式，為聯(lián)合用藥提供了佐證。大部分藥物耐受患者表現(xiàn)為穩(wěn)定的血小板高活性特點(diǎn)［6］，不因用藥時(shí)間和總量而變化，因此，在臨床條件下選擇一種具有足夠靈敏度的監(jiān)測手段顯得尤為重要。通過對有限志愿者的研究，筆者認(rèn)為盡管PFA-100和TEG能夠有效表達(dá)血小板功能的變化，仍然需要選擇合適的誘導(dǎo)劑才能特異性反映不同活化途徑的情況。

雖然本研究顯示服用氯吡格雷后CD62p表達(dá)減低，而且氯吡格雷也有抑制CD62p的作用，但是筆者認(rèn)為，流式細(xì)胞術(shù)所用的20μmol/L ADP遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于激活聚集所需的濃度(5μmol/L)，Geiger等［7］用5μmol/LADP刺激血小板觀察CD62p，就未發(fā)現(xiàn)安慰劑與氯吡格雷之間的差異。高濃度ADP將產(chǎn)生非嘌呤誘導(dǎo)的次級反應(yīng)，使血小板反應(yīng)缺乏特異性，PLUTO-Stroke試驗(yàn)也提示CD62p可能不適于評價(jià)氯吡格雷對血小板的抑制［8］。

本研究利用PFA-100和TEG這兩種新型床旁檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同途徑之間可能存在耦聯(lián)關(guān)系或交互作用，從方法學(xué)上佐證了聯(lián)合用藥的優(yōu)勢，另一方面也為研究血小板活化提出了新的思路。雖然不同方法之間未必存在量化關(guān)系，但是兩者之間的符合率和受試者的表現(xiàn)趨勢是一致的，這是推廣即時(shí)檢驗(yàn)技術(shù)的前提;在利用快速便捷優(yōu)勢的同時(shí)，使用者也應(yīng)充分了解各方法的潛在影響因素，杜絕片面結(jié)論的形成。

志謝衷心感謝李蕊女士和西門子公司提供支持

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Responses of different platelet activation pathways to Aspirin/Clopidogrel adm inistration in healthy volunteers

LI Jian1，CAO Jian2，WANG Cheng-bin1，WANG Hua-Zhong1，JIA Guan-zhou1，MO Yaming1，CONG Yu-long1.1 Clinical Laboratory Center，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China;2 First Department of Geriatric Cardiology

CONG Yu-long，Email:hemthm@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the inhibition profiles ofaspirin and clopidogrel on COX-1 and P2Y12 receptor，and potential interaction between them.MethodsA total of 20 healthy male volunteers were admitted and divided into two groups，clopidogrel group(75 mg/d)or aspirin group(100 mg/d)in consecutive 7 days.Platelet inhibition(%)，CEPI-CT/CADP-CT and CD62p were detected and recorded beforemedicine administration and at the 1st，3rd，5thand 7thday after withdraw.ResultsBoth CEPI-CT and CADP-CT changed significantly(F=27.2，P＜0.01 and F=25.3，P＜0.01)after clopidogrel use. CEPI-CT was increased significantly to 300s after aspirin administration(F=36.7，P＜0.01)，but CADPCT showed no changes(F=2.12，P=0.13).Inhibition rate of COX-1 induced by arachidonic acid (inhibitionAA)was increased to 91.7%±0.9%(F=35.1，P＜0.01)after aspirin administraion.In clopidogrel group，P2Y12receptor inhibition rate was increased from 47.8%±3.1%to 81.3%±3.8%(F =24.8，P＜0.01).CD62p expression was decreased by 50%in both groups(clopidogrel:F=28.7，P＜0.01;aspirin:F=20.7，P=0.02).ConclusionsCOX-1 activationmay interactwith P2Y12 receptor in clinical settings and platelet function testing is useful for dual-therapy.

Platelet;Acetylsalicylic acid;Clopidogrel;Point-of-care test

2012-02-09)

(本文編輯:周白瑜)

10.3969/j.issn.1007-5410.2012.04.009

100853北京，解放軍總醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心(李健、王成彬、王華忠、賈冠洲、莫亞明、叢玉隆)，南樓心血管一科(曹劍)

叢玉隆，電子信箱:hemthm@yahoo.com.cn