冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血蛋白激酶C受體蛋白表達(dá)與冠狀動(dòng)脈狹窄的關(guān)系

雷玉 平管軍 郭亮 邢明青 王旭

·臨床研究·

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血蛋白激酶C受體蛋白表達(dá)與冠狀動(dòng)脈狹窄的關(guān)系

雷玉 平管軍 郭亮 邢明青 王旭

目的探討冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血蛋白激酶C受體蛋白(RACK1)的表達(dá)變化及與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的關(guān)系。方法入選初診為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的患者83例，根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，采用冠狀動(dòng)脈狹窄程度積分評(píng)價(jià)其狹窄程度?；颊弑环譃?組:Ⅰ組(0分)即為對(duì)照組;Ⅱ組(1～10分);Ⅲ組(11～20分);Ⅳ組(＞20分)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(realtime PCR)檢測(cè)所有患者外周血RACK1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組的RACK1 mRNA表達(dá)水平均顯著高于Ⅰ組(t分別為10.62，12.90，14.00，均為P＜0.05)，而Ⅲ組和Ⅳ組又顯著高于Ⅱ組(t分別為9.40和10.74，均為P＜0.05)，Ⅲ組、Ⅳ組兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.43，P＞0.05)。相關(guān)分析顯示，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血RACK1 mRNA表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈狹窄程度存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)rs=0.59(P＜0.01)。結(jié)論RACK1在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中表達(dá)上調(diào)，且與冠狀動(dòng)脈狹窄程度相關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化，冠狀動(dòng)脈;蛋白激酶C受體蛋白;冠狀動(dòng)脈狹窄程度積分;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病，其病理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化。目前國內(nèi)外已有大量針對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究，產(chǎn)生了脂質(zhì)滲入學(xué)說、平滑肌突變學(xué)說、炎癥學(xué)說、內(nèi)皮損傷學(xué)說、單核-巨噬細(xì)胞作用學(xué)說等多種學(xué)說來闡述冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。而研究冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的相關(guān)分子改變，有助于發(fā)現(xiàn)可能的治療靶點(diǎn)。蛋白激酶C受體蛋白(receptor for activated C kinase 1，RACK1)是一種分子量為36000的含β-螺旋槳結(jié)構(gòu)的支架蛋白，是WD重復(fù)蛋白(含色氨酸-天門冬氨酸重復(fù)序列的蛋白)家族成員之一，調(diào)節(jié)多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［1］。RACK1最初被鑒定為哺乳動(dòng)物中蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的一種受體，協(xié)同βⅡPKC的胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)通路［2-3］。而如今被視為一種胞漿內(nèi)游離的支架蛋白，RACK1含7個(gè)WD40重復(fù)序列，通過不同的WD40位點(diǎn)，與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白相互作用，如PKC［4］、酪氨酸激酶、胰島素樣生長因子I［5-6］，參與細(xì)胞功能調(diào)控。目前，在動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)80多種蛋白與RACK1相互作用，調(diào)節(jié)多條胞內(nèi)信號(hào)通路［7-8］，并在酵母及植物RACK1的研究中取得了一些進(jìn)展［9］。

PKC屬于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的磷脂酰肌醇信號(hào)傳遞途徑，其功能表現(xiàn)為調(diào)控基因的表達(dá)和細(xì)胞周期，控制細(xì)胞膜的多種功能，參與炎癥過程和免疫應(yīng)答。研究表明，PKC升高在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮重要作用［10］，血管平滑肌細(xì)胞的增生和分化都伴有PKC活性的增強(qiáng)，而前者與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)［11］。RACK1作為PKC的1個(gè)錨合蛋白，是否在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中亦發(fā)揮重要作用，目前尚未見此方面相關(guān)研究。現(xiàn)已知RACK1廣泛存在于哺乳動(dòng)物多種組織以及外周血中［12］，本研究通過檢測(cè)CHD患者血液中RACK1的表達(dá)情況，探討其與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的關(guān)系，以期探索CHD新的診療靶點(diǎn)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

入選2011年1～7月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市立醫(yī)院心內(nèi)科初診為CHD的住院患者83例，年齡40～75歲，平均(62.3±9.6)歲。其中男性50例，女性33例。排除標(biāo)準(zhǔn):嚴(yán)重肝、腎疾病及急、慢性感染性疾病、腫瘤、結(jié)締組織病、紐約心功能分機(jī)Ⅳ級(jí)及其他不適合參加者。

1.2 冠狀動(dòng)脈狹窄程度評(píng)價(jià)

所有患者行冠狀動(dòng)脈造影，根據(jù)美國心臟學(xué)會(huì)/美國心臟協(xié)會(huì)(ACC/AHA)冠狀動(dòng)脈造影指南，采用Gensini評(píng)分系統(tǒng)對(duì)每支血管病變程度進(jìn)行定量評(píng)定［13］。(1)根據(jù)冠狀動(dòng)脈狹窄程度進(jìn)行基本評(píng)分:將冠狀動(dòng)脈狹窄25%、50%、75%、90%、99%和100%分別定為1、2、4、8、16和32分;(2)根據(jù)冠狀動(dòng)脈病變部位確定評(píng)分系數(shù):左冠狀動(dòng)脈主干×5;前降支近段×2.5，中段×1.5，心尖支×1，第一對(duì)角支×1，第二對(duì)角支×0.5;回旋支近段×2.5，鈍緣支×1，遠(yuǎn)段× 1，后降支×1，后側(cè)支×0.5;右冠狀動(dòng)脈近段×1，中段×1，遠(yuǎn)段×1，后降支×1。以每一冠狀動(dòng)脈的狹窄評(píng)分乘以該病變部位的系數(shù)，即為該病變的評(píng)分。一位患者如有多處病變，則各病變的評(píng)分累計(jì)總和為該患者冠狀動(dòng)脈病變程度的總評(píng)分。根據(jù)最終積分將患者分為Ⅰ組(0分)、Ⅱ組(1～10分)、Ⅲ組(11～20分)、Ⅳ組(＞20分)，其中Ⅰ組為無冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的對(duì)照組。所有患者均簽署知情同意書，研究方案通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 RACK1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

1.3.1 主要試劑(1)引物由美國Invitrogen公司合成，序列如下:RACK1引物上游為CACATTGGCCACACAGGCTATC，下游為TGTAAAGGTGTTTGCCTTCGTTGA，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為124 bp;內(nèi)參引物上游為GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，下游為TGGTGAAGACGCCAGTGGA，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為138 bp。(2)Trizol試劑購自Invitrogen公司。(3)realtime PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。(4)人淋巴細(xì)胞分離液購自北京Solarbio公司。

1.3.2 標(biāo)本處理及RNA提取83例患者均于冠狀動(dòng)脈造影術(shù)前1 d采靜脈血4 ml，用枸櫞酸鈉抗凝劑抗凝，用人淋巴細(xì)胞分離液(Ficolli)分離外周血單核細(xì)胞后加入1 ml Trizol，經(jīng)典法提取外周血總RNA。1.3.3 cDNA制備提取的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，行反轉(zhuǎn)錄。20μl反轉(zhuǎn)錄體系包括:2 μl10×RTmix，2μl超純dNTP，2μl Oligo-dT15，1μl Quant Reverse Transcriptase，13μl模板RNA。37℃孵育1 h。

1.3.4 real-time PCR檢測(cè)25μl反應(yīng)體系包括: 12.5μl SYBR Premix Ex Taq，0.5μl PCR Forward Primer，0.5μl PCR Reverse Primer，2μl DNA模板，9.5μldH2O。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s，94℃15 s、59℃15 s和72℃30 s(38個(gè)循環(huán))，72℃延伸10 min。反應(yīng)儀器為Rotor-gene3000 Real-Time PCR System。目的基因表達(dá)陽性的標(biāo)本熒光定量擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)S型，陰性標(biāo)本成不規(guī)則波浪線。以2－ΔΔCt表示樣品中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt =樣本Ct均值－內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt－(隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值－該樣品內(nèi)參Ct均值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組患者臨床特征和基線水平比較

4組患者的性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙史等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 各組樣本RACK1 mRNA的表達(dá)情況

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，RACK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量符合正態(tài)分布。Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組的RACK1 mRNA表達(dá)水平均顯著高于Ⅰ組(t分別為10.62，12.90，14.00，均為P＜0.05);而Ⅲ組和Ⅳ組的RACK1 mRNA表達(dá)水平又分別顯著高于Ⅱ組(t分別為9.40和10.74，均為P＜0.05)，但Ⅲ組和Ⅳ組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.43，P＞0.05)，見表2。各組RACK1及GAPDH擴(kuò)增曲線呈S型(圖1)，融解曲線為雙峰，排除非特異性擴(kuò)增及引物二聚體的出現(xiàn)(圖2)。

2.3 RACK1 mRNA表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的關(guān)系

Gensini積分為不連續(xù)變量，兩者相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，結(jié)果顯示4組樣本中，RACK1 mRNA表達(dá)水平與Gensini積分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為rs=0.59(P＜0.01)。

圖1 各組RACK1及GAPDH熒光定量擴(kuò)增曲線

圖2 各組RACK1及GAPDH熒光定量融解曲線

3 討論

本研究分析CHD患者與無冠狀動(dòng)脈粥樣硬化者RACK1表達(dá)水平在外周血中的差異，并借助Gensini積分來分析RACK1表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CHD患者外周血中RACK1 mRNA表達(dá)水平均顯著高于無冠狀動(dòng)脈粥樣硬化者，提示RACK1在CHD患者外周血中表達(dá)上調(diào)。相關(guān)分析顯示，CHD患者外周血RACK1 mRNA表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈狹窄程度存在相關(guān)性。

表2 各組樣本RACK1 mRNA表達(dá)水平及冠狀動(dòng)脈狹窄積分(ˉx±s)

RACK1作為一種錨定蛋白，可以與細(xì)胞中多種信號(hào)分子結(jié)合，參與細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而在各種生命活動(dòng)過程中扮演非常重要的角色，如細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡、胞漿移動(dòng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等。近年來的研究表明，異常表達(dá)的RACK1參與多種病理過程，如在口腔鱗癌、惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺鱗癌、乳腺癌中表達(dá)異常，與這些腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)［14］。RACK1作為一種新發(fā)現(xiàn)的骨成型蛋白受體Ⅱ的相互作用蛋白，屬于一種肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的反向調(diào)節(jié)因子，可能參與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)?。?2］。

現(xiàn)普遍認(rèn)為有多種因素參與動(dòng)脈粥樣硬化，而氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、細(xì)胞異常增殖和凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)失調(diào)是其發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，其中NAD(P)H氧化酶、內(nèi)皮源型一氧化氮合酶(endothelial-derived nitric oxide synthase，eNOS)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)則分別是這些環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵酶［15］。PKC正是通過調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵酶的活性及其表達(dá)，來參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。據(jù)此我們推測(cè)RACK1作為PKC的一種常見錨定蛋白，可能通過作用于PKC途徑，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。典型的RACK1調(diào)控PKC的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程如下:RACK1與活化態(tài)PKC結(jié)合，將PKC定位到40S核糖體上并磷酸化起始因子elF6，磷酸化的elF6從60S核糖體亞基釋放后允許60S亞基和40S亞基結(jié)合，從而形成80S核糖體并增強(qiáng)翻譯活性，調(diào)控目的基因的表達(dá)［16］。RACK1參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的具體機(jī)制尚不清楚，可能為RACK1表達(dá)上調(diào)，與PKC相互作用，使PKC介導(dǎo)的信號(hào)通路翻譯活性升高，從而導(dǎo)致NAD(P)H氧化酶、eNOS、MAPKs、MMPs等上述關(guān)鍵酶活性增高，進(jìn)一步引起過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷等不良過程，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。此推測(cè)有待進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等后續(xù)研究證實(shí)，本研究結(jié)果為在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中深入研究RACK1的作用機(jī)制和發(fā)展?jié)撛诘闹委煱悬c(diǎn)提供了理論依據(jù)。

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Expression of receptor for activated Ckinase 1 in peripheral blood and its relationship with the extent of coronary lesions in patients with coronary artery atherosclerosis

LEIYu-ping，GUAN Jun，GUO Liang，XING Ming-qing，WANG Xu.Department of Cardiology，the Affiliated Qingdao Municipal Hospital，Qingdao University Medical College，Qingdao 266071，China

GUAN Jun，Email:guanjun@medmail.com.cn
Thiswork was supported by a grant from Technological Fund Supported Program for Commonality of Qingdao (10-3-3-4-2-nsh)

ObjectiveTo explore the expression of receptor for activated C kinase 1(RACK1)in peripheral blood and its relationship with the extent of coronary lesions in patients with coronary artery atherosclerosis.MethodsA total of 83 patients with coronary artery atherosclerosis were enrolled. According to the results ofangiography，the extentof coronary stenosiswas evaluated by the coronary stenosis score.Patients were divided into four groups:groupⅠ(0 score，normal control group)，groupⅡ(1-10 scores);groupⅢ(11-20 scores)，and groupⅣ(＞20 scores).RACK1 mRNA expression in peripheral blood was detected by real-time polymerase chain reaction.ResultsThe RACK1 mRNA expression in peripheral blood in groupⅡ，groupⅢand groupⅣwere significantly higher than in groupⅠ(t=10.62，12.90，14.00，respectively，all P＜0.05).RACK1 mRNA expression in groupⅢandⅣwere significantly higher than in groupⅡ(t=9.40，10.74，respectively，both P＜0.05)，and there was no statistical significance between groupⅢand groupⅣ(t=1.43，P＞0.05).Correlation analysis showed that RACK1 mRNA expression in peripheral blood was positively correlated with the extent of coronary lesions(rs=0.59，P＜0.01).ConclusionsThe expression of RACK1 is up-regulated in peripheral blood in coronary artery atherosclerosis patients，and it is positively correlated with the extent of coronary lesions.

Atherosclerosis，coronary;RACK1;Gensini's degree integral;Real-time polymerase chain reaction

2012-01-11)

(本文編輯:譚瀟)

10.3969/j.issn.1007-5410.2012.04.007

青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(10-3-3-4-2-nsh)

266071青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市立醫(yī)院心內(nèi)科

管軍，電子信箱:guanjun@medmail.com.cn