木棉花花青素超聲波輔助提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

陳瓊 葉思霞

摘要：對提取工藝主要參數(shù)進(jìn)行三因素五水平試驗設(shè)計，采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取木棉花花青素的提取條件。結(jié)果表明，超聲波輔助提取的最佳工藝條件為提取時間５０ ｍｉｎ，料液比１∶４０（ｍ／Ｖ，ｇ：ｍＬ），超聲波功率２１０ Ｗ。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；木棉花；花青素；超聲波輔助提取

中圖分類號：Ｑ９４９．７５７．４；ＴＳ２６４．４ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）16－3575-04

Optimization of Extraction Conditions of Anthocyanins from Bombax malabaricum by Response Surface Methodology

ＣＨＥＮ Ｑｉｏｎｇ，ＹＥ Ｓｉ－ｘｉａ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０５２０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｏｍｂａｘ ｍａｌａｂａｒｉｃｕｍ ＤＣ． ｂｙ ｕｌｔｒａｗａｖｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｒｅｅ－ｆａｃｔｏｒ ｆｉｖｅ－ｌｅｖｅｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ， ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ， ５０ ｍｉｎ； ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ １∶４０（ｍ/Ｖ，ｇ∶ｍＬ）； ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ， ２１０ Ｗ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇy； Ｂｏｍｂａｘ ｍａｌａｂａｒｉｃｕｍ ＤＣ．； ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ； ｕｌｔｒａｗａｖｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

木棉花為木棉科植物木棉［Ｂｏｍｂａｘ ｍａｌａｂａｒｉｃｕｍ ＤＣ．］的干燥花朵，分布于海南省、臺灣省、廣西壯族自治區(qū)、云南省和四川省南部，在廣東省及福建省廣為栽培。廣東地區(qū)群眾慣用曬干的木棉花煮粥或者煲湯，其具有解毒、清熱、驅(qū)寒、去濕、解暑等功效，臨床上可用于治療泄瀉、痢疾、血崩、瘡毒、中暑等［１，２］。因此，木棉花既是食品又是藥品，是極具開發(fā)潛力的嶺南植物資源，深入開發(fā)、充分利用這一特色種質(zhì)資源對植物資源開發(fā)領(lǐng)域有重要的研究意義。

超聲波輔助提取技術(shù)是利用超聲波熱學(xué)原理、超聲波的機(jī)械作用和空化作用強(qiáng)化了提取過程的傳質(zhì)速率和效率，與傳統(tǒng)的提取法相比，大大縮短了提取時間，提高了提取效率，且提取液中雜質(zhì)更少，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取中［３］。目前，對木棉花的研究主要集中在木棉花提取物的抗炎、抗菌功效研究［４，５］；在木棉花提取工藝研究方面，葉斯琴等［６］、王輝［７］以木棉花紅色素的應(yīng)用為目標(biāo)，進(jìn)行了溶劑提取工藝研究。木棉花中紅色素的主要成分是花青素，而花青素在抗炎、調(diào)節(jié)血脂、改善胰島素抵抗、抗腫瘤等一系列促進(jìn)人體健康和預(yù)防疾病方面具有生物活性，是一種潛在的醫(yī)藥資源［８］。鑒于此，采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取木棉花花青素的工藝條件，旨在為木棉花的深入研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)打下基礎(chǔ)。

１材料與方法

１.１材料

１．１．１原料木棉花為２０１１年４月采自廣東省中藥研究所藥用植物標(biāo)本室。

１．１．２試劑ｐＨ １．０緩沖溶液的制備：準(zhǔn)確稱?。保矗?ｇ ＫＣｌ，用去離子水定容至１００ ｍＬ，將ＫＣｌ溶液與０．２ ｍｏｌ／Ｌ HCl以２６∶６７的體積比混合，用ＫＣｌ溶液調(diào)至ｐＨ １．０。ｐＨ ４．５緩沖溶液的制備：準(zhǔn)確稱取２．７２ g ＮａＡｃ·３Ｈ２Ｏ，用去離子水定容至１００ ｍＬ，調(diào)至ｐＨ ４．５。試劑為國產(chǎn)分析純。

１．1．３儀器與設(shè)備ＫＱ－５００ＧＴＤＶ高頻恒溫數(shù)控超聲清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司，冷凍干燥機(jī)購自德國Ｃｈｒｉｓｔ公司，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自瑞士步琦有限公司，ＵＶ１２００型紫外分光光度計購自日本日立公司。

１．２方法

１．２．１木棉花的處理方法采摘木棉花后，將其洗凈除雜陰干，采用冷凍干燥處理，粉碎過４０目篩，于－２０ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２木棉花花青素最大吸收波長的確定取５ ｇ木棉花干粉，按１∶３０（ｍ／Ｖ，ｇ：ｍＬ）加入含體積分?jǐn)?shù)為１％ HCl的乙醇溶液提?。保?ｈ，間隙式攪拌，過濾濾液后，濾渣再按上述步驟提取一次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去掉溶劑得到木棉花粗提物，用少量去離子水溶解后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，分別得三氯甲烷層、乙酸乙酯層、水層提取物，其中水層提取物為花青素粗提物。一般花青素及其衍生物的特征吸收波長為５２０～５４０ ｎｍ，將木棉花花青素提取物用適量去離子水稀釋后，調(diào)整至ｐＨ １．０，在５００～６００ ｎｍ波長范圍內(nèi)進(jìn)行可見光掃描，確定木棉花花青素的最大吸收波長。

１．２．３木棉花提取的響應(yīng)面試驗設(shè)計選擇提取溫度為３０ ℃，選用對花青素提取率影響較大的料液比、超聲波功率、提取時間共３個因素，以花青素提取率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計來優(yōu)化提取工藝，各因素與編碼水平見表１。

１．２．４木棉花色素的提取及提取率的測定方法?。?ｇ木棉花干粉，按一定料液比加入含體積分?jǐn)?shù)為１％ HCl的乙醇溶液提?。?ｈ后，置于超聲波發(fā)生裝置中進(jìn)行超聲波輔助提取，以６０ ｒ／ｍｉｎ搖床振蕩１０ ｍｉｎ后，過濾除濾渣，取上清液測定花青素提取率。

木棉花花青素提取率的測定采用ｐＨ示差法［９，１０］：取５ ｍＬ供試液，分別用ｐＨ １．０和ｐＨ ４．５的緩沖溶液定容至１０ ｍＬ，平衡３０ ｍｉｎ后在最大吸收波長下測吸光度，計算花青素提取率，重復(fù)試驗３次?；ㄇ嗨靥崛÷剩剑粒é拧粒蹋粒停住粒模啤粒郑祝簟粒保埃埃ァ?/p>

其中，Ａ為吸光度；ε為矢車菊素－３－Ｏ－葡萄糖苷的消光系數(shù)，為２６９ ００；Ｌ為光程，為１ ｃｍ；ＭＷ為矢車菊素－３－Ｏ－葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，為４４９．２（注：當(dāng)樣品花色苷單體成分未知時，一般用在植物中最為普遍的花色苷矢車菊素－３－Ｏ－葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)物）；ＤＦ為稀釋因子；Ｖ為最終體積，ｍＬ；Ｗｔ為產(chǎn)品質(zhì)量，ｍｇ；Ａ＝（Ａ５３０ ｎｍ，ｐＨ １．０－Ａ７００ ｎｍ，ｐＨ １．０）－（Ａ５３０ ｎｍ，ｐＨ ４．５－Ａ７００ ｎｍ，ｐＨ ４．５）。

１．２．５數(shù)據(jù)的分析試驗數(shù)據(jù)用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ８．０軟件進(jìn)行分析。

２結(jié)果與分析

２．１木棉花花青素最大吸收波長的確定

一般花青素類物質(zhì)的特征吸收波長為５２０～５４０ ｎｍ，將木棉花花青素待測液在５００～６００ ｎｍ波長范圍內(nèi)進(jìn)行可見光掃描，由圖１可知，木棉花花青素的最大吸收波長為５２０ ｎｍ。

２．２超聲波輔助提取工藝優(yōu)化模型的建立

２．２．１響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果采用響應(yīng)面法對提取工藝參數(shù)進(jìn)行三因素五水平的試驗設(shè)計，共２０個試驗方案，具體方案設(shè)計與結(jié)果如表２所示。

２．２．２回歸方程的建立與檢驗利用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ 8.0軟件對表２中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到木棉花花青素提取率的預(yù)測值對編碼因素Ａ、Ｂ和Ｃ的二次多項回歸方程：■＝０．３００ ００＋０．０１７ ００Ａ＋０．０１６ ００Ｂ＋０．０１７ ００Ｃ－０．００９ ８８ＡＢ－０．００６ ８８ＡＣ＋０．００５ ６３ＢＣ－０．０１９ ００Ａ２－０．０１０ ００Ｂ２－０．００９ ２２Ｃ２，R=0.906 0。

由表３的方差分析可知，回歸方程的失擬性檢驗不顯著，可以認(rèn)為所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)?；回歸模型的決定系數(shù)為０．９０６ 0，說明該模型能夠解釋９０．６％的變化，因此可用此模型對木棉花花青素提取率進(jìn)行分析和預(yù)測，對實踐具有指導(dǎo)意義。

２．２．３各因素影響程度和因素間交互作用分析由方差分析結(jié)果可知，試驗所建立的回歸模型中，超聲波功率、提取時間、料液比對木棉花花青素提取率均有顯著影響（Ｐ＜０．０５），而三因素兩兩之間的交互作用不顯著。超聲波功率、提取時間的二次項對花青素提取率有顯著影響，而料液比的二次項時花青素提取率有極顯著影響。根據(jù)二次回歸方程得到參數(shù)和響應(yīng)值之間的響應(yīng)曲面及等高線如圖２、圖３和圖４所示。

圖２中等高線的形狀反映出超聲波功率和料液比的交互效應(yīng)，在試驗水平范圍內(nèi)，超聲波功率增大，花青素提取率呈增大趨勢。在其他因素不變的前提下，料液比減小，花青素提取率隨之增大，到達(dá)最高值后反而降低。要達(dá)到同樣的花青素提取率，料液比越大，所需要的超聲波功率越大。在試驗水平范圍內(nèi)，花青素的提取率存在極大值。

由圖３的提取時間和料液比的交互效應(yīng)可知，提取時間的增大有利于花青素的溶出，提取率呈增大趨勢。在其他因素不變的前提下，料液比減小，花青素提取率隨之增大，到達(dá)最高值后反而降低。原因可能是由于料液比的減小使分離效率降低，而過高的超聲波功率或過長的提取時間會導(dǎo)致花青素的分解，造成損失。因此，當(dāng)料液比、提取時間和超聲波功率合理搭配時才能獲得較好的提取效果。

由圖４可知，在試驗水平范圍內(nèi)，隨著超聲波功率或提取時間的增大，花青素提取率呈增大趨勢。因此，適當(dāng)加大超聲波功率和提取時間能提高花青素的提取率，但當(dāng)超聲波功率和提取時間超過一定值，花青素提取率增加不明顯。

２．２．４工藝參數(shù)的優(yōu)化與驗證經(jīng)過軟件分析，最佳的提取條件為：料液比１∶４０（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同），超聲波功率２１０ Ｗ，提取時間５０ ｍｉｎ。按最佳提取條件進(jìn)行３次驗證試驗，測得花青素提取率為０．３１６％，與理論值接近，相對誤差為０．８１％。證明該模型適用于預(yù)測該工藝，重現(xiàn)性好。

３小結(jié)與討論

采用響應(yīng)面分析法，通過中心組合試驗直觀地分析多種因素之間的交互作用，并能在試驗設(shè)計的整個區(qū)域范圍內(nèi)找到考察因素的最佳細(xì)化值。而常用的正交設(shè)計法只能在試驗所選取的因素與水平內(nèi)進(jìn)行選擇。

試驗曾對乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、超聲波功率、提取時間、料液比等單因素進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于木棉花色素主要是花青素，乙醇體積分?jǐn)?shù)增大有利于木棉花色素的提取，而且加入少量HCl有利于提高花青素的穩(wěn)定性，但HCl體積分?jǐn)?shù)較大時，濃縮蒸發(fā)會降解花青素，不利于提取，因此選用含體積分?jǐn)?shù)為１％ HCl的乙醇溶液作為提取溶劑。而高溫和光照對花青素破壞較大，因此，提取過程適宜在室溫下避光進(jìn)行。最終確定超聲波功率、提取時間和料液比作為響應(yīng)面設(shè)計試驗的考察因素。

試驗采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行木棉花花青素提取工藝的研究，確定超聲波輔助提取的最佳工藝條件為料液比１∶４０，超聲波功率２１０ Ｗ，提取時間５０ ｍｉｎ。該工藝的提取率高、操作簡便，為木棉花中色素的提取提供了試驗依據(jù)。

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