采用催化自溶和生物破壁技術(shù)提取啤酒酵母細胞壁多糖

段勝林，王雪，苑鵬，劉炎橋，劉杰，劉士偉

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

采用催化自溶和生物破壁技術(shù)提取啤酒酵母細胞壁多糖

段勝林，王雪，苑鵬，劉炎橋，劉杰，劉士偉

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

以廢棄啤酒酵母為原料采用催化自溶與生物破壁技術(shù)生產(chǎn)細胞壁多糖。經(jīng)過單因素試驗后確定了酵母自溶的適宜條件:50～60℃，pH 5.0～6.0，食鹽濃度0.8%，VB2濃度 200 mg/L，料液比(g∶mL)1∶8～10，剪切微化處理約9 h以上。此外，確定了采用60℃下，1∶10的料液比，0.02%～0.03%的蛋白酶添加量和2%的NaOH濃度為細胞壁多糖的適宜提取條件。此方法得到的細胞壁多糖中甘露聚糖的含量＞22%，葡聚糖的含量＞35%。同時發(fā)現(xiàn)使用酪蛋白鈉和改性淀粉作為酵母提取物的微膠囊化材料時，產(chǎn)品噴霧效果好，且不吸潮。

廢棄啤酒酵母，催化自溶，細胞壁多糖，功能食品

啤酒廢棄酵母的排放量是啤酒產(chǎn)量的2%，我國啤酒廢棄酵母的排放量高達30萬t/年[1］。啤酒廢酵母中含有48%～55%的蛋白質(zhì)、23%～28%的碳水化合物，6%～8%的核糖，微量VB2和谷胱苷肽以及豐富的氨基酸和多種礦物質(zhì)等[2］。如果這些啤酒廢酵母隨廢水排放，不僅沒有得到利用，反而造成嚴重的環(huán)境污染[3］。目前，國內(nèi)對酵母提取物(酵母精)的研究與生產(chǎn)比較多，但對酵母壁多糖的綜合利用研究較少[4］。

啤酒酵母細胞壁中含有大量的多糖，約為酵母細胞干重的40%。其外側(cè)部分是含甘露糖的多糖體，內(nèi)側(cè)部分是葡聚糖[5］。這2種糖在人體消化道中穩(wěn)定性好，活性高，具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，如對沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、肉毒梭狀芽孢桿菌和肉毒梭狀芽孢桿菌等有很好的抑制作用，對雙歧桿菌、干皓乳桿菌、嗜酸乳桿菌和德爾布呂克乳桿菌等益生菌有明顯促進繁殖的作用[6］。此外，酵母細胞壁多糖對沙門氏腸炎桿菌、摩氏變形菌、檸檬酸桿菌具有100%的截取作用;其通過物理吸附或直接結(jié)合霉菌毒素而不影響其他成分，對黃曲霉菌素、玉米赤霉烯酮和豬曲霉毒素的結(jié)合率分別為82.5%、51.6%和26.4%，效果顯著;加之細胞壁多糖天然、安全、可靠，因此成為抗生素替代品的開發(fā)熱點[7］。

在食品工業(yè)中，酵母細胞壁多糖能充當乳化劑、增稠劑、低熱食品原料等角色，另外作為一種高效免疫因子，它可直接食用[8］。據(jù)報道，由于酵母細胞壁多糖的分子結(jié)構(gòu)特殊性，它能有效激活人體免疫應(yīng)答系統(tǒng)，識別病毒并殺滅病毒;同時，當人體在受到外界環(huán)境巨大變化時，酵母細胞壁多糖能夠提高人體的應(yīng)激能力，防止傳染性疾病的發(fā)生[9］。

由于酵母細胞中的蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)與細胞壁多糖以絡(luò)合物的形式存在，因此需要對細胞壁多糖進行分離、提取后再利用。目前主要有堿法、高壓均質(zhì)法、酶法來提取酵母細胞壁多糖[10］。本研究采用催化自溶與生物破壁技術(shù)的方法生產(chǎn)細胞壁多糖，顯著減少了酵母細胞的自溶時間，有效保護了甘露聚糖和葡聚糖的天然結(jié)構(gòu)，同時采用膜分離技術(shù)分離提純，實現(xiàn)了清潔生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

啤酒廢酵母泥，取自北京燕京啤酒股份有限公司。

堿性蛋白酶、NaOH、NaCl、HCl、乙醇、淀粉、VB2、明膠、阿拉伯膠、酪蛋白鈉、甲基纖維素、聚乙二醇、葡聚糖、甘露聚糖等，均為分析純。

1.2 實驗儀器

離心機(Avanti J25)，美國BECKMAN公司;噴霧器(20L 8AH)，山東沂星植保機械廠;烘干箱(DGG-9036A)，上海林頻環(huán)境設(shè)備廠;pH計(HANNA 30100-0165)，上海艾測科技有限公司;紫外分光光度計(SPECORD 200)，德國耶拿公司;高效液相色譜儀(Agilent 1200)，安捷倫科技有限公司;雙酚A聚砜中空纖維膜(MAX-UF-110×900)，杭州泓泉膜技術(shù)有限公司;大型超濾裝置(CLQ-125)，無錫昌林自動化科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 啤酒廢棄酵母細胞壁多糖提取分離的工藝

1.3.2 啤酒廢棄酵母的預(yù)處理

廢棄啤酒酵母分為干基啤酒酵母和濕基啤酒酵母。不同啤酒生產(chǎn)企業(yè)的廢棄啤酒酵母隨種齡、營養(yǎng)條件差異而不同，主要表現(xiàn)為自身酶活力的差異。本實驗選用的是低溫干燥(50～70℃)的干基啤酒酵母。干基啤酒酵母先用清水清洗，再用篩網(wǎng)過濾，然后用離心機脫水，以除去酒類干物質(zhì)和干燥時帶來的異物。

1.3.3 啤酒廢棄酵母自溶的影響因素

酵母的提取方法有多種，包括酶法、酸法和自溶等，從環(huán)保和生產(chǎn)可行性上考慮，通常選用自溶方式提取酵母提取物，但自溶方式時間較長，影響生產(chǎn)效率，實驗發(fā)現(xiàn)添加自溶促進劑(食鹽和VB2)可催化自溶，顯著縮短自溶時間。本實驗通過設(shè)計單因素實驗，研究了溫度、時間、pH值、食鹽和VB2、剪切微化、料液比共7個因素各自對廢棄啤酒酵母的自溶影響程度，并確定干基啤酒酵母的適宜自溶條件。

1.3.4 酵母提取物的微膠囊化

酵母提取物非常容易吸潮，不容易粉末化，采用微膠囊包埋技術(shù)可以解決其粉末化問題，微膠囊包埋方法很多，包括噴霧干燥法、相分離法、包結(jié)絡(luò)合法、空氣懸浮法和界面聚合法等。本實驗選用噴霧干燥法使酵母提取物粉末化，使用噴霧干燥微膠囊包埋的關(guān)鍵是囊壁材料的選擇，根據(jù)酵母提取物的成分以及工業(yè)生產(chǎn)的可行性，選用明膠和阿拉伯膠、改性淀粉、酪蛋白鈉、酪蛋白鈉和改性淀粉、聚乙二醇、甲基纖維素作為囊壁實驗材料，通過制成品的吸潮程度和噴霧效果來判定囊壁材料的類型。

1.3.5 酵母細胞壁的生物破壁技術(shù)方法優(yōu)化

破碎細胞壁結(jié)構(gòu)的方法有:有機溶劑法、超微粉碎法、微波法與生物發(fā)酵法等。本實驗采用生物發(fā)酵法，該法具有酵母細胞破碎完全、使用方便、設(shè)備簡單以及安全無殘留等特點。本實驗研究了不同酶制劑對酵母細胞壁的破壁效果以及蛋白酶對酵母細胞壁多糖提取效率的影響，同時研究了溫度、破碎時間、pH值、料液比對提取率的影響，并確定適宜工藝參數(shù)。

1.3.6 酵母細胞壁多糖提取液的超濾處理

酵母細胞壁多糖提取液中含有細胞壁多糖、細胞壁殘渣以及大量的鹽分和小分子糖，通過離心分離去除細胞壁殘渣，然后采用超濾去除鹽和小分子糖，從而獲得高純度的細胞壁多糖溶液。處理工藝如下:

此工藝的核心問題是超濾分離，通過透析可去除大部分鹽分和小分子糖分，本實驗研究了不同透析下的脫鹽效果與多糖截留率，考慮到生產(chǎn)的可行性和膜裝置的成熟性，并選用雙酚A聚砜中空纖維膜進行了脫鹽透析試驗。

1.3.7 分析檢測方法

(1)可溶性固形物含量的測定:采用手持折射儀法。

(2)細胞壁多糖含量的測定:采用酸水解的方法將廢棄啤酒酵母細胞壁多糖降解為單體，再利用高效液相色譜儀對相對單體進行定量分析[11］。

(3)提取得率的計算

m1為提取液的可溶性固形物含量，m2為原料的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度、時間、pH值、自溶促進劑和料液比等單因素對啤酒廢棄酵母自溶的影響

2.1.1 溫度、時間、pH值、剪切微化作用等因素對啤酒廢棄酵母自溶的影響

在料液比為1∶10，不添加自溶促進劑的條件下，分別考察在pH值為6.0，自溶9 h時溫度對啤酒酵母自溶的影響，在pH值6.0，溫度為50℃時自溶時間對啤酒酵母自溶的影響，在溫度為50℃，自溶9 h時pH對啤酒酵母自溶的影響，以及剪切微化作用對啤酒酵母自溶的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 溫度(a)、pH值(b)、處理時間(c)和剪切時間(d)等單因素對酵母自溶的影響

圖1-(a)表示酵母在pH值6.0，自溶9 h的條件下，溫度為50～60℃時，啤酒酵母的自溶效果較好，這與張曉鳴等報道的啤酒酵母最佳自溶溫度(54℃)相符[12］。從圖1-(b)可以看出，隨著時間的延長，可溶性固形物的含量越來越高，8 h處理時間下的固形物含量是2 h條件下的2倍多。但9 h后，可溶性固形物的增長變緩，考慮到實際生產(chǎn)效率情況，酵母的自溶時間選為9 h為宜。酵母的自溶也是在其體內(nèi)酶的作用下進行的，而環(huán)境的pH值將直接影響到酵母細胞體內(nèi)酶的活性。酵母在50℃，不同pH值條件下，自溶9 h后，其可溶性固形物的含量變化如圖1-(c)所示，當pH值為5.0～6.0時，酵母自溶效果較好。圖1-(d)表明，剪切微化時間越長，可溶性固形物有增高的趨勢，說明剪切微化可以提高酵母自溶的效率，但變化不顯著，考慮到生產(chǎn)的簡便性，只是將料液均質(zhì)一遍，而不作其他剪切微化處理。

2.1.2 NaCl、VB2等自溶促進劑和料液比對啤酒廢棄酵母自溶的影響

在酵母自溶過程中，添加自溶促進劑可加速酵母的自溶，提高酵母提取物的溶出率，縮短自溶時間。從食品安全性考慮，生產(chǎn)中選用食鹽和VB2作為酵母自溶促進劑，考慮到產(chǎn)品的口感以及維生素的限量添加，NaCl的添加量定為0.8%，VB2定為200 mg/L，在料液比為1∶10，pH值為6.0，溫度為50℃的條件下考察自溶促進劑對酵母自溶的影響，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，添加NaCl和VB2對酵母自溶效率有影響，兩者均可縮短自溶時間。如在0.8%的NaCl濃度下，僅需5 h就能使可溶性固形物含量達到5%，而無NaCl的情況下需要10 h才能達到相同的水平[圖2-(a)］。同樣，添加VB2也可以大大縮短自溶時間，從而達到加速催化自溶的效果[圖2-(b)］。

除了自溶促進劑對酵母自溶有一定的作用外，在pH值為6.0，溫度為50℃，自溶9 h時，不同料液比對啤酒酵母自溶的影響，實驗結(jié)果如表1所示。

表1 料液比對啤酒廢棄酵母自溶的影響

圖2 食鹽(a)和VB2(b)對酵母自溶的影響

表1可以看出，料液比越高，提取率越大，但是考慮到實際生產(chǎn)情況以及生產(chǎn)成本，合理的料液比為1∶8～10。因此，啤酒酵母在均質(zhì)一遍后的適宜自溶條件為:自溶溫度是50～60℃，pH值為5.0～6.0，自溶時間為4～5 h，VB2添加量為200 mg/L，NaCl濃度為0.8%，料液比為1∶8～10。在此條件下的最終提取得率可達70%。

2.2 酵母提取物的微膠囊化實驗結(jié)果

本實驗采用離心噴霧進行酵母提取物粉末化(微膠囊化)，根據(jù)噴霧塔的特性，選擇進風(fēng)溫度160～170℃，排風(fēng)溫度80～90℃，塔溫92～100℃，酵母提取物濃度35%～40%。影響酵母提取物粉末化最主要因素是囊壁材料的類型與比例，根據(jù)酵母提取物的特性，可選擇的微膠囊化囊壁材料包括明膠、阿拉伯膠、改性淀粉、酪蛋白鈉、聚乙二醇和甲基纖維素等，在噴霧過程中溶化后的壁材在酵母提取物顆粒表面形成覆膜，可有效阻隔空氣中水分的進入，預(yù)防產(chǎn)品吸潮。在囊壁材料含量為3%的條件下，各種囊壁材料的微膠囊化效果如表2所示。

表2 各種囊壁材料對微囊化的噴霧效果

從表2可以看出，明膠、阿拉伯膠或者聚乙二醇和甲基纖維素作為囊壁材料時，容易出現(xiàn)噴霧產(chǎn)品凝結(jié)且嚴重粘壁的現(xiàn)象，單獨使用改性淀粉或酪蛋白鈉作為囊壁材料，噴霧產(chǎn)品容易吸潮成凝結(jié);但是當組合使用酪蛋白鈉和改性淀粉時，噴霧時不粘壁，粉末化效果好，產(chǎn)品不吸潮。在此基礎(chǔ)上，按照1∶1，1∶2，2∶1不同比例混合酪蛋白鈉和改性淀粉，將囊壁材料含量分別定為2%、3%、4%、5%時，考察其噴霧效果。實驗表明，酪蛋白鈉和改性淀粉的比例為1∶1，囊壁材料含量為3%時，噴霧不粘壁，下粉正常，產(chǎn)品不吸潮，收粉率達到89%。

2.3 酶制劑、溫度、時間、pH值、堿濃度對廢棄啤酒酵母生物破壁的影響

2.3.1 酶制劑對廢棄啤酒酵母生物破壁的影響

各種酶制劑對酵母細胞壁的破壁效果不同。本試驗采用蛋白酶，葡萄苷酶和黃藤節(jié)桿菌酶3種酶對廢棄啤酒酵母進行破壁處理，結(jié)果表明葡萄苷酶破壁不完全，得率低;黃藤節(jié)桿菌酶和蛋白酶的破壁效果都非常好，但是黃藤節(jié)桿菌酶的價格高。綜合考慮，使用蛋白酶對廢棄啤酒酵母進行破壁處理是較佳選擇。因此，設(shè)計了不同濃度的蛋白酶并進行了酵母破壁試驗，見表3。

表3 蛋白酶的添加量對酵母細胞壁多糖提取率的影響

表3結(jié)果顯示，添加蛋白酶濃度越高，提取率越大，從產(chǎn)業(yè)化和成本方面綜合考慮，選擇蛋白酶添加量為0.02%～0.03%即可滿足實際生產(chǎn)需要。

2.3.2 溫度、時間、pH值以及NaOH濃度對生物破壁的影響

在確定了蛋白酶用量0.02%、料液比為1∶10后，分別考察在pH值為12.0，NaOH濃度為3%，反應(yīng)5h的條件下，反應(yīng)溫度對破壁的影響;在溫度為50℃，pH值為12.0，NaOH濃度為3%的條件下，反應(yīng)時間對破壁的影響;在溫度為50℃，NaOH濃度為3%，反應(yīng)5h的條件下，pH對破壁的影響;以及在溫度為50℃，pH值為12.0，反應(yīng)5h的條件下，NaOH濃度對破壁的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3表示溫度、反應(yīng)時間、pH值和NaOH濃度對生物破壁效率的影響。考慮到酵母細胞本身的結(jié)構(gòu)耐性和蛋白酶的最適作用條件，實驗結(jié)果表明作用溫度在50～60℃為宜[圖3-(a)］;在溫度為50℃，pH值為12.0，NaOH濃度為3%的條件下，反應(yīng)時間越長，破壁效果越好，但是考慮到維持作用溫度需要的能耗和實際破壁效率，適宜反應(yīng)時間為5 h[圖3-(b)］;圖3-c顯示pH值對生物破壁有非常顯著的影響，堿性條件下(pH 12)的破壁效果是酸性條件下(pH 4)的2倍還多，因此本實驗設(shè)計了不同質(zhì)量濃度NaOH，觀察堿濃度對生物破壁的影響[圖3-(d)］。圖3-(d)表明，將 NaOH濃度從3%提高到6%，可溶性固形物的產(chǎn)量增加不明顯，堿濃度過高反而會造成產(chǎn)物雜質(zhì)太多，還可能造成環(huán)境污染，故選擇3%濃度添加量為宜。此外，本實驗還研究了料液比對提取率的影響，發(fā)現(xiàn)料液比為1∶10時，生物破壁效率最高。因此，綜合以上單因素實驗，提取細胞壁多糖的最宜工藝參數(shù)是:堿濃度為3%;溫度為50℃;時間為5 h;料液比為1∶10。在此工藝條件下，細胞壁多糖提取率為85%。

圖3 溫度(a)、作用時間(b)、pH值(c)和NaOH濃度(d)對生物破壁效率的影響

2.4 酵母細胞壁多糖提取液的超濾實驗結(jié)果

根據(jù)細胞壁多糖的分子量和溶液特性，文中選用雙酚A聚砜中空纖維膜，膜面積為0.25 m2，截留分子質(zhì)量70 ku，實驗最高溫度為50℃，流量為20～50 L/h，影響超濾的因素很多，包括pH值、透析比、澄清度等，其中pH值決定于提取液，為9.5，澄清度可由離心決定，因此重點考察透析比對脫鹽效率和多糖截留率的影響，實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4顯示，透析比越大，脫鹽效率越高，但多糖截留量越少，因此根據(jù)兩者的綜合結(jié)果分析，確定適宜的透析比為2.0，此時，脫鹽效率達到90%，蛋白含量＜5%，多糖截留量大于85%，其中，甘露寡聚糖 ＞22%，葡聚糖＞35%。

2.5 酵母細胞壁多糖的產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測結(jié)果

圖4 透析對脫鹽率和多糖殘留率的影響

因為糖的保留時間隨水的比例減小而減少，故可以采用高效液相色譜儀對糖進行分析。結(jié)果顯示得到的酵母細胞壁多糖產(chǎn)品質(zhì)量如下:甘露聚糖 ＞22%，葡聚糖＞35%，細胞壁多糖的提取得率＞85%。此外，實驗過程中，經(jīng)測定水回收率＞70%，排出的廢水指標(COD＜200 mg/L，BOD＜150 mg/L)達到國家廢水排放標準。

3 結(jié)論

本實驗采用催化自溶與生物破壁技術(shù)生產(chǎn)細胞壁多糖，通過一系列實驗，最終確定了酵母細胞壁多糖的適宜提取條件。在此條件下，可以顯著減少酵母細胞的自溶時間，有效保護甘露糖和葡聚糖的天然結(jié)構(gòu)。同時采用聚砜超濾膜分離技術(shù)分離提純，實現(xiàn)了清潔生產(chǎn)，最終可使甘露糖得率＞22%，使葡聚糖得率＞35%，產(chǎn)物脫鹽率＞90%，多糖截留率＞85%。本實驗中，除了制備的細胞壁多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用和吸附病原菌及霉菌毒素的功效之外，另外一種產(chǎn)物酵母提取物(酵母精)是兼具營養(yǎng)、調(diào)味等功能的優(yōu)良食品添加劑和調(diào)味劑，可廣泛應(yīng)用到調(diào)味料、香精、休閑食品和焙烤食品等諸多領(lǐng)域。

利用啤酒酵母生產(chǎn)高品質(zhì)酵母提取物和細胞壁多糖的項目研究，可降低啤酒企業(yè)的環(huán)保費用，增加企業(yè)的經(jīng)濟效益，替代進口產(chǎn)品，因此，該項目具有顯著的經(jīng)濟效益和社會效益。

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ABSTRACTThis paper discussed the use of waste beer yeast to produce cell wall polysaccharides with catalytic autolysis and cell wall deconstruction technology.Through single factor experiments，the best autolysis efficiency of the yeast were as follows:50～60℃，pH 5.0～6.0，0.8%NaCl and 200 mg/L VB2，solid-liquid ratio 1∶(8～10)，shearing treatment at least 9h.Also，the best extraction conditions for extraction polysaccharide were:60℃，solidliquid ratio 1/10，0.02%～0.03%protease and 2%NaOH.In this method，we can get at least 22%poly-mannose and 35%poly-glucan from the cell wall polysaccharides.Sodium casein and modified starch combination was the best microencapsulated material due to its good spray effect and moisture resistance.

Key wordsbeer waste yeast，catalytic autolysis，cell wall polysaccharides，functional foods

Extraction of Polysaccharide from Brewer＇s Yeast Cell Wall Using Catalytic Autolysis and Biological Cell Wall Deconstruction Technology

Duan Sheng-lin，Wang Xue，Yuan Peng，Liu Yan-qiao，Liu Jie，Liu Shi-wei
(China Natiunal Research Institute of Food ＆ Fermentation Industries，Beijing 100027，China)

碩士，高級工程師。

2012-03-01，改回日期:2012-03-23