花生中輔酶Q10的提取工藝及含量測定*

王改玲，宋瑞雯，陶志杰，孫曉俠

1(蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠，233030)

2(遼寧師范大學生命科學院，遼寧大連，116081)

花生中輔酶Q10的提取工藝及含量測定*

王改玲1，宋瑞雯2，陶志杰1，孫曉俠1

1(蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠，233030)

2(遼寧師范大學生命科學院，遼寧大連，116081)

花生中富含輔酶Q10，以高效液相色譜法測量的輔酶Q10含量為指標，系統(tǒng)研究了利用超聲波細胞破碎儀從花生中提取輔酶Q10時不同提取條件對其含量的影響。結果表明:4個因素對提取率影響大小的順序為:提取功率＞提取時間＞單次輻射時間＞料液比，其中提取功率和提取時間對花生中輔酶Q10的提取率有極顯著影響。最佳工藝參數(shù)為:提取功率400 W，提取時間15 min，單次輻射時間為6.0 s/5.0，料液比為1∶6，在此條件下花生中輔酶 Q10的提取率為92.4 μg/g。

花生，輔酶Q10，高效液相色譜法

輔酶Q10是一種脂溶性的類維生素物質(zhì)，廣泛存在于動物、植物、微生物等細胞的線粒體上，主要結合在線粒體內(nèi)膜上，構成呼吸鏈中的重要遞氫體。具有清除自由基、維持細胞膜的通透性和提高機體自身免疫力的功能，對心臟、肝臟和腎臟有較好的保健作用，在臨床上廣泛用于心血管疾病、肝病、中風和癌癥的治療[1-2］。此外，由于輔酶Q10所具有的獨特生理活性在食品添加劑、化妝品等行業(yè)也具有廣闊的應用前景。資料顯示，目前全球輔酶Q10的年消費量高達500多噸，而我國年需求量約為60多噸。目前輔酶Q10的制備方法主要有生物組織提取法、微生物發(fā)酵法和化學合成法3種[3-5］。對輔酶Q10的生物組織提取主要集中在煙草等植物，而研究表明花生中也含有大量的輔酶Q10[6］，而關于花生中輔酶Q10報道很少，本課題組主要研究如何利用當?shù)氐拇罅炕ㄉY源，從中制備輔酶Q10，旨為花生中輔酶Q10的開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

花生，購自安徽蚌埠。

三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、無水乙醇等試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);輔酶Q10標準品(阿拉丁試劑，分析標準品≥98%);HPLC所用流動相為色譜級甲醇。

高效液相色譜儀(Waters 2487紫外檢測器，Wa-ters 1575二元泵);UH-500B型超聲波細胞粉碎儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司;RE52CS型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;BS224S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;FW-100型高速萬能粉碎機，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取輔酶Q10標準品10 mg于25 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇適量振搖溶解并稀釋至刻度。制成400 μg/mL的標準儲備液。準確量取儲備液0.1、1、2、4、6 mL分別置于10 mL容量瓶中并用無水乙醇定容至刻度，制成系列標準溶液待測。

1.2.2 輔酶 Q10含量測定

采用HPLC法測定輔酶Q10含量，色譜條件為:以V(甲醇)∶V(乙醇)=30∶70為流動相，色譜柱溫度:35℃;流速:1 mL/min;樣品進樣體積 20 μL;檢測波長:275 nm。記錄輔酶Q10峰面積，利用回歸方程求的其含量。

1.2.3 輔酶 Q10提取方法[7］

稱取干燥粉碎好的樣品5 g置于50 mL離心管中，加入30 mL甲醇，浸提5min，離心(3000 r/min，10 min)去上清液。固形物中加30 mL溶劑，不同條件下利用超聲波破碎儀提取。提取液離心得上清液，重復一次，合并上清液。將上清液減壓濃縮至半干，浸膏中加5 mL流動相，在超聲波清洗儀中溶解3 min，溶液用0.45 μm濾膜過濾，收集濾液待測。

1.2.4 單因素試驗

以提取量為測定指標，進行單因素試驗以確定提取溶劑、超聲波輸出功率、超聲波單次輻射時間、提取總時間、料液比5個因素對輔酶Q10提取量的影響。

1.2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行4因素3水平正交試驗，采用L9(34)正交實驗設計方案進行優(yōu)化提取實驗，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 線性范圍和精密度試驗

取標準系列溶液進行HPLC進樣分析，進樣量10 μl，以峰面積對濃度進行線性回歸，得到回歸方程Y=11798X+1370.4。R2=0.9992(n=5)表明輔酶Q10在4～240 μg/mL內(nèi)積分面積和濃度線性關系良好。取濃度80 μg/mL的標準溶液連續(xù)進樣5次，其峰面積RSD=0.5%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同提取溶劑對輔酶Q10提取量的影響

在其他超聲波提取條件固定的情況下，利用不同的溶劑提取發(fā)現(xiàn)。如圖1所示，不同提取溶劑提取效果差異較大。乙醇溶液的提取率最低僅為33 μg/g，三氯甲烷和乙酸乙酯的提取率較高，可以達到81 μg/g，且兩者相差不大。考慮到三氯甲烷對人體危害性大于乙酸乙酯，故選用乙酸乙酯作為提取溶劑。同時發(fā)現(xiàn)，如果在用超聲波細胞破碎儀提取前用甲醇處理，4種溶劑的提取率都有所提高，其中乙酸乙酯提高了8﹪。而且得到的色譜圖較沒用甲醇處理的雜質(zhì)數(shù)量要少些，峰型也要好一些。主要可能因為用甲醇短時間處理可以去點一些脂溶性雜質(zhì)，同時也使溶劑的的細胞組織穿透力增強，有利于目標成分的提取。

2.2.2 超聲波提取時間對輔酶Q10提取量的影響

如圖2所示，在其他提取條件相同的情況下，隨著提取時間的延長，輔酶Q10的提取率有明顯增高的趨勢，提取5min時輔酶Q10含量僅為37 μg/g，當提取時間為10 min時，輔酶Q10含量增高了48%。15 min后，輔酶Q10含量達到最高88 μg/g。然而其含量并沒有隨著時間的延長一直增高。提取20 min時含量較15 min時不但沒有增加，反而呈下降趨勢，這可能是因為隨著提取時間的延長，大量輔酶Q10被提取到溶劑中，但是同時由于受氧氣和光照的影響輔酶Q10也在不斷地降解而導致的。同時考慮到提取時間越長雜質(zhì)含量也越多，為后面的純化分離增加困難，因此，選用提取時間15 min為最佳提取時間。

圖1 不同提取溶劑對輔酶Q10提取量的影響

圖2 超聲波提取時間對輔酶Q10提取量的影響

2.2.3 超聲波提取功率對輔酶Q10提取量的影響

從圖3可以看到，輔酶Q10提取量隨著超聲波提取功率的增加呈先升后降的趨勢。提取功率小于200 W時輔酶Q10含量較低，考慮主要可能是因為功率過小，花生組織不能被完全破壞，使得輔酶Q10不能完全溶解到溶劑中，增加功率有利于溶劑中空穴效應的形成，從而產(chǎn)生大量空化泡，使得破碎作用加強，大量輔酶Q10被釋放到溶劑中，故提取功率從100 W升到400 W時輔酶Q10含量隨提取功率的增加而增加。然而提取功率＞400 W時輔酶Q10含量卻又呈下降趨勢，主要可能是由于超聲波處理引起的局部高溫高壓使溶液中H和OH自由基含量增加而導致輔酶Q10氧化降解[8］。故選擇超聲波提取功率400 W為花生中輔酶Q10的最佳提取功率。

2.2.4 超聲波單次輻射時間對輔酶Q10提取量的影響

圖3 超聲波提取功率對輔酶Q10提取量的影響

在超聲波提取功率為400 W，提取時間15 min，料液比例為1∶5的條件下，由圖4可知，超聲波單次輻射時間在6.0～8.0 s，間歇時間5 s時提取效果較好。超聲波破碎細胞的過程也就是空化泡形成、震動、膨脹、壓縮和崩潰閉合的過程[9，10］。當單次輻射時間低時，輔酶Q10提取量較少，這是由于輻射時間過短，超聲波空化效應不能發(fā)揮爆裂破壁作用導致的。但是當單次工作時間超過8.0 s后，雖然能產(chǎn)生大量空化泡而是細胞破裂，但同時會產(chǎn)生較多活性氧而引起輔酶Q10含量下降。因此，最佳的單次超聲時間/間歇時間為 6.0 s/5.0 s～8.5 s/5.0 s。

圖4 超聲波單次輻射時間對輔酶Q10提取量的影響

2.2.5 料液比對輔酶Q10提取量的影響

由圖5可以看出，提取溶劑量為20 mL時，輔酶Q10提取量較小，這一方面是因為溶液中花生組織濃度大，不利于空化泡的形成;另一方面是因為提取溶液少時，溶液中的輔酶Q10濃度較大，在離心過濾時大量輔酶Q10黏附在花生殘渣上損失而導致含量減少。當料液比大于1∶5時，增加料液比對輔酶Q10提取量的影響幅度不是很大。料液比從1∶4增加到1∶5，輔酶Q10提取量提高了32%，而料液比從1∶5增加到1∶8，輔酶Q10提取量僅僅提高了26%。這主要是因為利用超聲波細胞破碎儀提取不同于傳統(tǒng)的浸提法，提取量受細胞內(nèi)外濃度差的影響較小。料液比大于1∶8后，提取量下降可能是由于溶劑量加大后，超聲波在溶劑中傳遞的損失增大，細胞破碎效果變差導致的。故料液比為1∶7為花生中輔酶Q10的最佳溶劑用量。

2.3 正交試驗

圖5 料液比對輔酶Q10提取量的影響

超聲波破碎法提取花生中輔酶Q10的正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析結果

從表2和表3可以看出超聲波功率和提取時間對輔酶Q10提取量有極顯著影響，超聲波單次輻射時間影響顯著，而料液比對輔酶Q10提取量的影響較小。4個因素對提取率影響大小的順序為:提取功率＞提取時間＞單次輻射時間＞料液比。綜合各因子的k值比較可得到A2B2C3D3為最佳提取條件，即提取時間15 min，輸出功率400 W，單次輻射時間10.0 s/5.0 s，溶劑用量為 40 mL，即料液比為 1∶8。取 5份花生材料在此條件下做驗證試驗得輔酶Q10平均提取量為 92.4 μg/g，RSD=1.18%

2.4 超聲波破碎儀提取與傳統(tǒng)提取方法比較

取5 g花生材料3份，分別采用浸提法、超聲波破碎儀提取和堿醇皂化法提取[4-5］，結果顯示超聲波法輔助提取效果更佳，輔酶Q10提取量為91.9 μg/mL，碘醇皂化法輔酶Q10提取量為56.3 μg/mL，普通浸提法提取量最低僅有30 μg/mL。所以用超聲波破碎儀提取輔酶Q10操作簡便，省時，提取效率高。

3 結論

本研究優(yōu)化了超聲波破碎儀提取輔酶Q10的提取工藝，確定最佳提取工藝為提取時間15 min，輸出功率400 W，單次輻射時間10.0 s/5.0 s，溶劑用量為40 mL，即料液比為1∶8。在該條件下輔酶Q10平均提取量高達92.4 μg/g。和其他傳統(tǒng)方法相比，提取率高，省時省力，且操作方便。對于花生中的輔酶Q10的工業(yè)化提取具有良好的應用前景。后續(xù)的研究工作主要集中在如何分離富集花生中的輔酶Q10。

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ABSTRACTPeanut contains coenzyme Q10，the content of Q10was detected by HPLC.The effect of different conditions by using ultrasonic cell-break method for extraction was systematically studied.The results showed that the size order of influence by four factors on the extraction rate was:extraction power＞extraction time＞duration of radiation each time＞ratio of material to liquid.The power extraction and extraction time had significant effect on the extraction rate of coenzyme Q10.The optimal condition for coenzyme Q10extraction was as follows:400W，extraction time:15min，duration of radiation:6.0s/5，ratio of solid to liquid:1∶6.Under this condition，the coenzyme Q10extraction rate was 92.4ug/g.

Key wordspeanut，coenzyme Q10，HPLC

Extraction Technology and Content Determination of Coenzyme Q10in Peanut

Wang Gai-ling1，Song Rui-wen，Tao Zhi-jie1，Sun Xiao-xia1
1(Department of Biology and Food Engineering，Bengbu College.Anhui，Bengbu 233030，China)
2(Life Science College，Liaoning Normal University，liaoning，Dalian 116081，China)

碩士研究生，講師(陶志杰為通訊作者)。

*蚌埠學院院級科研項目(2010ZR17)

2012-04-02，改回日期:2012-04-26