胃蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究*

龐美蓉，丁秀臻，孔祥珍，華欲飛

(江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，食品學院，江蘇無錫，214122)

胃蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究*

龐美蓉，丁秀臻，孔祥珍，華欲飛

(江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，食品學院，江蘇無錫，214122)

采用胃蛋白酶對大豆分離蛋白進行酶法水解，隨著酶解時間的延長，蛋白質(zhì)的水解度逐漸增大，水解6 h，DH為7.90%。采用分子篩凝膠過濾色譜(SE-HPLC)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對不同的酶解時間下大豆分離蛋白酶解物的分子結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果表明，胃蛋白酶選擇性地酶解大豆11 S球蛋白。大豆分離蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解6 h后，分子量大于10 ku的部分占21.34%，其中主要是7 S球蛋白;分子量小于5 ku的部分所占比例為68.30%。對酶解物中的游離巰基和二硫鍵含量測定結(jié)果表明，隨著酶解的進行，游離巰基的含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，二硫鍵的含量總體變化不大。該研究旨在更好地了解胃蛋白酶水解大豆分離蛋白的機理，并為開發(fā)大豆分離蛋白酶解物產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

大豆蛋白，胃蛋白酶，水解，分子量

大豆蛋白中90%的蛋白質(zhì)以儲藏蛋白的形式存在，主要分為大豆球蛋白(glycinin)和β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)[1］。大豆球蛋白也稱作11 S，分子質(zhì)量為340～375 ku，主要由酸性亞基(A1、A2、A3、A4、A5和A6，分子質(zhì)量為38 ku)和堿性亞基(B1、B2、B3、B4、B5、B6，分子質(zhì)量為20 ku)通過二硫鍵連接形成(A4酸性亞基除外)。β-伴球蛋白也稱作7 S，分子質(zhì)量為180～210 ku，主要由α、α'和β三種亞基所組成，分子質(zhì)量分別為65、62和57 ku[2］。大豆蛋白含有人體所需的8種必需氨基酸，且比例合理，其賴氨酸含量可以與動物蛋白相媲美;大豆蛋白具有優(yōu)良的乳化性、發(fā)泡性和凝膠性，是食品工業(yè)重要的蛋白質(zhì)。但是，大豆蛋白質(zhì)由于其分子量大、溶解度低、含有抗營養(yǎng)因子以及具有抗原性等因素而大大限制了大豆蛋白產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域。

蛋白質(zhì)酶促水解是在水溶液中通過酶的催化作用，使蛋白質(zhì)中的肽鍵斷裂，生成胨、肽等低分子量產(chǎn)物的生化反應(yīng)過程。蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解有助于改善其營養(yǎng)價值和功能性質(zhì)，從而拓寬其應(yīng)用范圍。大豆蛋白水解能改善溶解度、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)以及降低過敏性，產(chǎn)品能應(yīng)用于乳制品、肉類、飲料以及嬰兒食品中，在食品蛋白質(zhì)配料加工方面有著特殊意義[3-6］。

本研究采用胃蛋白酶對大豆分離蛋白進行酶法水解，測定其酶法水解進程曲線，采用分子篩凝膠過濾色譜(SE-HPLC)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對不同的酶解條件下大豆分離蛋白酶解物的分子結(jié)構(gòu)進行表征，并對酶解物中的巰基/二硫鍵含量進行測定，旨在更好地了解胃蛋白酶水解大豆分離蛋白的機理，并為開發(fā)大豆分離蛋白酶解物產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

全脂豆粕，山東萬德福有限公司;胃蛋白酶，諾維信生物技術(shù)有限公司;三硝基苯磺酸(TNBS)、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)，Sigma公司;乙腈，色譜純;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

LGJ-10冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠;高速冷凍離心機，日本日立公司;ECP3000三恒電泳儀，北京市六一儀器廠;Waters 600高效液相色譜、Spectrumlab22PC分光光度計，美國Waters公司;分析天平，上海天平儀器廠，F(xiàn)A1004型;868型pH計，上海熱電儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆蛋白的制備

醇洗豆粕按1∶15的料液比加入去離子水，充分溶解，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0，室溫下低速攪拌1 h，以10000 r/min在4℃離心30 min，棄去沉淀。上清液用2 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 4.5，以10000 r/min在4℃離心30 min，棄去上清液，得到的蛋白質(zhì)凝乳經(jīng)水洗后，加入去離子水并用2 mol/L的NaOH將溶液回調(diào)至pH 7.0，經(jīng)攪拌充分溶解后，溶液在4℃以10000 r/min離心30 min以棄去少量不溶物質(zhì)，上清液經(jīng)透析24 h除鹽后冷凍干燥，干燥的大豆分離蛋白在4℃條件下保存。

1.3.2 胃蛋白酶水解大豆分離蛋白

大豆分離蛋白5%分散于水中，調(diào)節(jié)pH2.0，溫度37℃，攪拌10 min，加入胃蛋白酶(酶與底物的比為1∶100)，進行酶反應(yīng)，反應(yīng)過程中保持pH恒定。控制反應(yīng)時間分別為0.5、1、2、3、4、5、6 h。反應(yīng)完畢，調(diào)節(jié)水解液至pH7.0終止反應(yīng)，以10000 r/min在4℃離心20 min，收集上清液和沉淀。冷凍干燥后在4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 水解度的測定

水解度(DH)的測定采用三硝基苯磺酸法[7］。標準曲線由L-Leu(0～2.0 mmol/L)來制備。水解度的計算:

式中:AN1指蛋白水解前氨基氮的含量，mg/g(蛋白);AN2指蛋白水解后氨基氮的含量，mg/g(蛋白);Npb指蛋白底物中肽鍵的氮含量，Npb對于大豆球蛋白來講為109.2 mg/g。

1.3.4 分子量分布的測定

采用高效液相色譜法(HPLC)。色譜儀，美國Waters公司;色譜柱:TSKgel 2000SWXL 300 mm×7.8 mm(Tosoh，Japan);流動相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1;檢測:UV(220 nm);流速:0.5 mL/min;柱溫:30℃;分子量校正曲線所用標準品:細胞色素C(MW 12500 u)，抑菌肽(MW6500 u)，桿菌肽(MW1450 u)，Gly-Gly-Arg-Tyr(MW 451 u)，Gly-Gly-Gly(MW 189 u)。

1.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

天然大豆蛋白及蛋白質(zhì)聚集體的電泳采用SDSPAGE，根據(jù)Laemmili的方法在DYCZ-24B型垂直電泳槽制膠[8］。分離膠、濃縮膠的濃度分別為12.5%和4%。

1.3.6 游離巰基含量的測定

將樣品(30 mg/mL)溶解在含pH 8.0的0.15 mol/L的Tris-HCl緩沖液中，取1 mL樣品，加入135 μL DTNB(0.01 mol/L)，25℃反應(yīng)30 min，以10000 r/min離心20 min后在412 nm處測定吸光度。樣品中游離巰基含量的計算:[9］

注:N為巰基含量，單位μmol/g;A412為樣品在412 nm處的吸光度;D為樣品的稀釋度;C為樣品中蛋白質(zhì)的濃度，mg/mL。

1.3.7 二硫鍵含量的測定

將樣品(10 mg/mL)溶解在含pH8.0的0.15 mol/L的Tris-HCl(含8 mol/L鹽酸胍)緩沖液中。取0.5 mL樣品加入4.2 μL NEM(0.2 mol/L)黑暗中反應(yīng)1h將游離巰基封閉。封閉游離巰基后的樣品中加入0.5 mL 2.5%硼氫化鈉進行二硫鍵的還原。之后采用游離巰基含量的測定方法來進行二硫鍵含量的測定，二硫鍵的含量以半胱氨酸的含量(μmol/g蛋白)來表示，即2×(S—S)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆分離蛋白的水解曲線

采用三硝基苯磺酸法測定胃蛋白酶水解大豆分離蛋白的進程曲線，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，隨著酶解時間的延長，蛋白質(zhì)的水解度逐漸增大。尤其在最初的30 min水解速率很大，之后變得比較平緩。究其原因，隨著酶解反應(yīng)的進行:①底物濃度減小，反應(yīng)位點逐漸被酶分子飽和;②產(chǎn)物濃度增加，其競爭性抑制變強;③酶活性降低;④中間復合物[ES］在經(jīng)歷了初始階段的積累后達到穩(wěn)態(tài)，趨于恒定。上述因素綜合作用的結(jié)果使得酶解速率隨時間延長而逐漸減小。胃蛋白酶水解大豆分離蛋白6 h，其DH達到7.90%。

圖1 胃蛋白酶水解大豆分離蛋白的水解進程曲線

2.2 大豆分離蛋白水解物的SE-HPLC圖譜分析

采用SE-HPLC對不同水解時間下制備的大豆分離蛋白酶解物(未離心)、上清液和沉淀的分子量分布進行表征，結(jié)果如表1～表3所示。原料大豆分離蛋白(SPI)基本在空體積處流出。隨著酶解時間的延長，酶解物的分子量逐漸減小。大豆分離蛋白酶解上清液和沉淀的分子量分布范圍都比較寬廣。比較表2和表3可以發(fā)現(xiàn)，上清液中小分子量肽段所占的比例明顯要高于沉淀中。隨著酶解時間的增加，酶解液離心后所得沉淀的量逐漸減少，酶解6 h后，離心未得到沉淀。值得注意的是，盡管胃蛋白酶水解大豆分離蛋白6 h后，分子量大于10 ku的部分仍占較大比例。

表1 大豆分離蛋白總酶解物的分子量分布

表2 大豆分離蛋白酶解物上清液的分子量分布

表3 大豆分離蛋白酶解物沉淀的分子量分布

2.3 大豆分離蛋白水解物的SDS-PAGE分析

為了更清楚地了解胃蛋白酶水解大豆分離蛋白的機理，對不同酶解時間下制備的大豆分離蛋白酶解物進行了SDS-PAGE表征。由圖2可以看出，胃蛋白酶在pH 2.0，37℃下水解大豆分離蛋白，酶解時間0～6 h，大豆分離蛋白中的伴球蛋白成分7 S的條帶并未發(fā)生較大的變化。可見胃蛋白酶水解主要作用于大豆球蛋白11 S。當酶解時間為0.5 h時，11 S的A肽鏈和B肽鏈的條帶已經(jīng)幾乎不可見。結(jié)合上述SE-HPLC的實驗結(jié)果，可見分子量大于10 ku的部分中，7 S蛋白占了很大比例。7 S球蛋白和11 S球蛋白因為其結(jié)構(gòu)上的差異而表現(xiàn)出不同的功能性質(zhì)，這個結(jié)果為選擇性地酶解某一種蛋白來開發(fā)具有特定功能的大豆蛋白產(chǎn)品提供了一個很好的思路。

在此基礎(chǔ)上，我們對大豆分離蛋白胃蛋白酶酶解物的上清液和沉淀進行了SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。未發(fā)生酶解的7 S球蛋白在上清液和沉淀中都占較大的比例。

2.4 大豆分離蛋白酶解物的游離巰基和二硫鍵含量分析

圖4 大豆分離蛋白酶解物沉淀的SDS-PAGE的電泳圖譜

大豆球蛋白11S富含Cys，達42 mol/mol[10］。組成11 S的5種亞基分別為A1bB2，A2B1a，A1aB1b，A3B4和A5A4B3，其中每種亞基均由一條酸性肽鏈(A)和一條堿性肽鏈(B)通過一個二硫鍵連接而成。亞基根據(jù)其同源性分成兩類，Ⅰ型亞基含有3個二硫鍵，2個游離巰基;Ⅱ型亞基含有2個二硫鍵，2個游離巰基[11］。由SDS-PAGE結(jié)果表明，采用胃蛋白酶進行大豆分離蛋白的酶解，11 S球蛋白幾乎被完全酶解。針對11 S球蛋白中Cys含量高的分子特點，對大豆分離蛋白的酶解物中的巰基、二硫鍵含量進行測定，以期更進一步地了解胃蛋白酶酶解大豆分離蛋白在分子水平上發(fā)生的變化。如圖5所示，在總酶解物、上清和沉淀中，游離巰基的含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。這可能是由于隨著水解的進行，原本包埋在球蛋白內(nèi)部的巰基由于蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而暴露出來從而使得測定的游離巰基含量增大。之后繼續(xù)酶解，來源于7 S亞基、A肽鏈、B肽鏈的肽段之間可能發(fā)生聚集(部分通過二硫鍵相連)從而導致巰基含量減少。

隨著大豆分離蛋白的酶解，蛋白結(jié)構(gòu)展開，并逐漸被水解為低分子量的肽段。大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)中的巰基、二硫鍵也會發(fā)生交換反應(yīng)[12］。對大豆蛋白酶解物的上清液和沉淀中的二硫鍵的含量測定結(jié)果表明，隨著酶解時間的延長(0～6 h)，二硫鍵含量總體變化不大(約為45 μmol/g蛋白，如圖6所示)。

圖5 大豆分離蛋白酶解物的游離巰基含量

圖6 大豆分離蛋白酶解物上清和沉淀的二硫鍵含量

3 結(jié)論

(1)采用胃蛋白酶對大豆分離蛋白進行酶法水解，隨著酶解時間的延長，蛋白質(zhì)的水解度逐漸增大，水解6 h，DH為7.90%。

(2)采用分子篩凝膠過濾色譜(SE-HPLC)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對不同的酶解條件下大豆分離蛋白酶解物的分子結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果表明，胃蛋白酶選擇性地酶解大豆11 S球蛋白。大豆分離蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶解6 h后，分子量大于10 ku的部分占21.34%，其中主要是7 S球蛋白;分子量小于5 ku的部分所占比例為68.30%。

(3)對酶解物中的游離巰基含量測定結(jié)果表明，隨著酶解的進行，游離巰基的含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，二硫鍵的含量總體變化不大。研究結(jié)果旨在更好地了解胃蛋白酶水解大豆分離蛋白的機理，并為開發(fā)大豆分離蛋白酶解物產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

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ABSTRACTSoy protein extract was enzymatically hydrolyzed with Pepsin.With the increase of soy protein hydrolysis，the degree of hydrolysis values varied from 0%to 7.90%after 360 min of incubation.The molecular weight distribution of soy protein hydrolysates prepared with Pepsin was determined by SE-HPLC and SDS-PAGE.The results showed that soy glycinin(11S)was selectively hydrolyzed by Pepsin.The molecular weight distribution of the hydrolysates obtained after6h of incubation were as follows:21.34%were above 10 ku and 68.30%were below5kDa.Soy conglycinin played a big role on the MW above 10 kDa.With the hydrolysis，free sulfhydryl content first increased and then decreased，while the content of disulfide bonds had no obvious change.The results herein were helpful for understanding the mechanism of soy protein hydrolysis with Pepsin，and could serve as a guide for the development of soy protein hydrolysate products.

Key wordsSoy protein，Pepsin，Hydrolysis，Molecular weight

Enzymatic Hydrolysis of Soy Protein Extract with Pepsin

Pang Mei-rong，Ding Xiu-zhen，Kong Xiang-zhen，Hua Yu-fei
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

本科生(孔祥珍教授為通訊作者)。

*國家自然科學基金(No.21146002)，項目名稱:酶水解大豆蛋白中二硫鍵分布、結(jié)構(gòu)狀態(tài)以及非天然結(jié)構(gòu)連接模式的全局性表征;江蘇省自然科學基金(No.BK2011151)，項目名稱:大豆蛋白酶水解產(chǎn)物的巰基二硫鍵狀態(tài)及其對其性質(zhì)的影響;國家重點實驗室建設(shè)項目計劃(No.SKLF-ZZB-201202)，項目名稱:江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室開放課題資助課題

2012-04-25，改回日期:2012-05-22