17β-雌二醇通過microRNA-29b調節(jié)NK細胞干擾素γ的分泌①

李鵬飛 郭 葳 趙俊麗 王亞平 胡婭莉 侯亞義

(南京大學醫(yī)學院免疫與生殖生物學實驗室，南京210093)

內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)在胚胎著床和妊娠的維持方面有著緊密的聯(lián)系。妊娠過程中，雌激素是母體分泌的主要激素，在胎盤和外周血清中維持較高的濃度水平，它主要通過基因組和非基因組效應結合到細胞的胞內或膜上的受體蛋白，在整個孕期發(fā)揮著非常重要的作用。有報道稱，占母胎界面淋巴細胞70%的蛻膜自然殺傷細胞(dNK)是局部血管生長和重塑的關鍵參與者［1］，對胚胎的正常植入和母胎界面免疫平衡的維持起重要作用［2，3］，同時又受到微環(huán)境中高濃度雌激素的調節(jié)，提示妊娠的發(fā)展和結局與雌性激素濃度以及dNK的活性變化有關聯(lián)。

關于雌激素對NK細胞的調節(jié)作用報道較少，Jiang等［4］為雌激素能調控NK細胞的表型與功能，我們前期通過對小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，17β-雌二醇(E2)能夠降低小鼠NK細胞增殖活性和抑制細胞因子IFN-γ的表達［5］。最近越來越多的學者關注到子宮NK細胞分泌的IFN-γ在母胎界面的重要性，認為IFN-γ在子宮螺旋動脈血管的構建與重塑、蛻膜的完整性扮演著不可忽視的重要角色［6-8］。而且我們通過構建先兆子癇樣小鼠動物模型，了解到子宮中NK細胞數(shù)目下降［9］。也有研究表明，與同期對照比較，先兆子癇患者E2水平在妊娠過程中發(fā)生異常變化［10］。以上研究提示母胎界面E2的變化以及NK細胞數(shù)目、活性的改變與先兆子癇的發(fā)病之間存在有一定聯(lián)系。

MicroRNA是一種短的(19-25nt)非編碼的內源性的RNA，通過與靶mRNA的3'UTR非翻譯區(qū)結合來促進靶mRNA的降解和/或抑制翻譯進而發(fā)揮負調控基因表達的作用，參與多種生物學過程的調控［11］。2008 年 Chim 等［12］闡述了母血中胎盤來源的microRNAs的存在及其穩(wěn)定性和生理特性，認為母血中胎盤來源的microRNAs可以作為一種新的檢測妊娠有關疾病的標志。我們通過分析先兆子癇患者胎盤microRNA芯片結果，首次發(fā)現(xiàn)了miR-29b在患者胎盤中高表達，提示miR-29b在妊娠過程中起著重要的作用，可能導致了先兆子癇的發(fā)生［13］。目前，對于E2是否影響人自然殺傷細胞株NK92細胞的IFN-γ的分泌，其對miR-29b的調節(jié)機制如何，尚不清楚。

在本文中，我們通過不同時間運用E2處理活化的NK92細胞，試圖了解其對 IFN-γ和miR-29b的影響，并探討miR-29b對IFN-γ的作用機制，從而為進一步揭示雌激素對NK細胞功能的調節(jié)機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品試劑和儀器 α-MEM、RPMI1640培養(yǎng)基和優(yōu)級胎牛血清(Gibco);小鼠抗人IFN-γ APC及同種型對照單抗(BD Pharmingen);poly I:C(Invitrogen);重組人IL-2(Pepro Tech);佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)和莫能霉素(e-Bioscience);17β-雌二醇E2(Sigma);pEGFP-C1質粒(Clontech);Lipofectamine 2000(Invitrogen);ERα和 ERβ多抗、GAPDH單抗及山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology);microRNA片段 pre-miR-29b、pre-miR-nc(Ambion);人 IFN-γ ELISA試劑盒(BD Biosciences);T4 DNA連接酶、限制性內切酶、質粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒、基因組DNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品。高壓滅菌鍋(TO-MY);超凈臺(Baker);CO2培養(yǎng)箱(Heraeus);Labofuge400R冷凍離心(Heraeus);流式細胞儀FACSCalibur(BD)。

1.1.2 細胞 人自然殺傷細胞株NK92由中國科學技術大學免疫學研究所田志剛教授惠贈，人胚腎293A細胞株購自ATCC。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 NK92培養(yǎng)于α-MEM培養(yǎng)基(含12.5%馬血清、12.5%胎牛血清、100 U/ml rhIL-2)，293A培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。細胞用0.25%的胰酶消化傳代。我們用E2(10－7mol/L)和poly I:C(50 μg/ml)處理 NK92 細胞4、8、12 和24小時。關于雌二醇和poly I:C的使用濃度，我們依據(jù)為前期的實驗結果以及參照文獻推薦的濃度［5，14，15］。

1.2.2 普通RT-PCR反應 細胞總RNA提取按照Trizol試劑盒中的說明書進行操作，逆轉錄得到cDNA，反應條件:42℃ 20分鐘，99℃ 5分鐘，4℃ 5分鐘。PCR擴增反應體系25 μl，反應條件:94℃ 10分鐘，94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒，35個循環(huán)，72℃ 10分鐘，用1.5%的瓊脂糖作凝膠電泳后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析。引物序列如下:內參對照β-actin:上游5'-AAATCGTGCGTGACATTAA-3'，下游5'-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3';ERα:上游5'-TGCCAAGGAGACTCGCTACT-3'，下 游 5'-CTGGCGCTTGTGTTTCAAC-3';ERβ:上游 5'-TGAAAAGGAAGGTTAGTGGGAACC-3'，下 游 5'-T GGTCAGGGACATCATCATGG-3'(英駿公司合成)。

1.2.3 Real-time PCR(qRT-PCR)檢測 IFN-γ 和miR-29b的表達 miR-29b的qRT-PCR采用Chen等［16］的方法，20 μl逆轉錄反應包括 4 μl 5 × RT buffer，2 μl 0.1 mol/L DTT，0.5 μl dNTPs(10 mmol/L)，1 μl M-MLV 逆轉錄酶，0.2 μl RNase 抑制劑(40 U/μl)，2 μl混合的逆轉錄引物(可生成一個含有多個microRNAs的庫)和無酶水至20 μl，反應程序為16℃ 30分鐘，42°C 30分鐘和85℃ 5分鐘。隨后，進行定量 PCR，20 μl反應體系包括 1 μl RT 產(chǎn)物(1∶10 稀釋)，0.6 μl通用下游引物，0.6 μl上游引物，10 μl 2 × TransStart SYBR Green qPCR Supermix，0.4 μl Passive Reference Dye，無酶水至 20 μl。反應在96孔板孵育，采用Applied BioSystems 7300 Sequence Detection System，程序為95℃ 10分鐘，隨后95℃ 15秒，60℃ 1分鐘，40個循環(huán)。結果處理用U6 snRNA作為內參。IFN-γ的定量PCR擴增反應體系同上，內參用β-actin。引物序列如下:IFN-γ:上游引物5'-CTCTTGGCTGTTACTGCCAGG-3'，下游引 物 5'-CTCCACACTCTTTTGGATGCT-3'。成 熟miR-29b片段的檢測所用引物序列如下:逆轉錄引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGT TGAGAACACTGA-3';qPCR上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCACCATTTGAAA-3';通用下游引物5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3';U6:上游引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.4 免疫印跡檢測蛋白 收集各組細胞離心后，加入細胞裂解液作用幾秒鐘，收集裂解后液體于EP管中，冰上放置30分鐘，之后10 000 rcf離心5分鐘，吸取上清－70℃凍存，備用。使用前，先用BCA法測蛋白濃度，讀取OD562值，從標準曲線查出蛋白濃度，調節(jié)蛋白濃度使每個樣品的上樣總蛋白量為50 μg。樣品加loading buffer煮5～10分鐘后，跑10%SDS-PAGE電泳，電泳結束后，100 V恒壓轉印90分鐘到0.45 μm PVDF膜上。轉印結束后，把含有樣品的PVDF膜用TBS配制的3%脫脂奶粉室溫封閉2小時;按說明書使用量分別加入1∶1 000稀釋兔抗人ERα和ERβ多克隆抗體和1∶500稀釋GAPDH單抗，4℃孵育一抗過夜，TBS洗3次，每次5分鐘，加入1∶3 000稀釋的 HRP-羊抗兔二抗，37℃反應1小時，TBS洗5次，每次5分鐘，化學發(fā)光，顯影，定影，拍照。

1.2.5 流式細胞術檢測IFN-γ的表達 將NK92細胞鋪于48孔板，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，用 E2(10－7mol/L)和 poly I:C(50 μg/ml)處理4、8、12和24小時。在處理結束前的4小時，用50 ng/ml的PMA和1 μg/ml的Ionomycin刺激NK92細胞，30分鐘后加入莫能霉素(終濃度為1.7 μg/L)。收集細胞，PBS洗滌兩次，調整細胞密度約1×109L－1。加500 μl 4%PFA室溫固定20分鐘，PBS洗1次;500 μl 0.1%皂苷的 PBS打孔孵育15分鐘，離心去上清，留約80 μl PBS，用別藻青蛋白(APC)標記的抗人IFN-γ單抗進行標記染色，4℃避光孵育30分鐘后，用含0.1%皂苷的 PBS洗滌2次。流式細胞儀檢測FL2通道總的10 000細胞，用CellQuestTM軟件分析NK92細胞IFN-γ的平均熒光強度(MFI)。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測IFN-γ的分泌分別取E2刺激NK92細胞 4、8、12和24小時的培養(yǎng)液上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測IFN-γ的含量。

1.2.7 載體構建 根據(jù)IFN-γ 3'UTR序列設計引物，末端加上相應的酶切位點及保護堿基，引物序列為:上游:5'-TGAAGCTTTGGTTGTCCTGCCTGCA-3'(HindⅢ);下游:5'-GCGAATTCGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATA-3'(EcoRⅠ)。從人基因組中用PCR方法擴增，反應條件:94℃預變性5分鐘后，94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，進行30個循環(huán)，產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化。PCR產(chǎn)物及pEGFP-C1質粒均經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后回收，用T4 DNA連接酶連接上述兩個酶切產(chǎn)物，16℃連接過夜。將產(chǎn)物轉化到制備好的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，卡那抗性篩選重組質粒，pEGFP-C1-IFN-γ 3'UTR酶切鑒定后送上海華大公司測序分析。

1.2.8 瞬時轉染 293A細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉染前鋪12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至60% ～80%時，用脂質體Lipofectamine 2000為介質按照說明書分別轉染pre-miR-29b、pre-nc和重組質粒pEGFP-C1-IFN-γ 3'UTR(1μg)，轉染后細胞用 Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基孵育6小時后換完全培養(yǎng)基。轉染48小時后，用流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白GFP的表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗結果以x±s表示，采用GraphPad Prism 5 Demo軟件進行統(tǒng)計學處理和繪圖，多均數(shù)比較采用方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05具有統(tǒng)計學差異、P＜0.01和P＜0.001具有顯著差異。

2 結果

2.1 NK92表達ERα和ERβ 有文獻報道，人外周血NK細胞表達 ERα 和 ERβ［17］，我們前期結果表明小鼠脾臟NK細胞表達雌激素受體。那么，人自然殺傷細胞株NK92是否也表達ERα和ERβ呢?我們分別用半定量RT-PCR和Western blot來檢測NK92中ERα和ERβ的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，NK92在基因水平和蛋白質上都能檢測到ERα和ERβ的表達，而且ERβ的表達水平比ERα高(圖1)。

2.2 E2抑制NK92細胞IFN-γ的表達 前面結果表明，NK92表達雌激素受體，這提示 E2可能對NK92起作用。已知NK細胞在機體早期的抗感染免疫中通過分泌IFN-γ發(fā)揮著重要的作用。為了進一步研究E2對NK92細胞IFN-γ的調控作用，我們將NK92細胞鋪于24孔板，分別設對照組、E2組、poly I:C組和E2及poly I:C聯(lián)合處理組，每組設3個復孔，處理4、8、12和24小時后收集細胞及上清，從基因和蛋白水平來檢測IFN-γ的表達情況。首先我們用定量PCR分析IFN-γ的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在8、12和24小時時間點，poly I:C處理后IFN-γ表達顯著升高，這證實NK92活化成功。E2單獨處理后，IFN-γ變化不明顯。而與poly I:C組相比，E2和poly I:C聯(lián)合刺激可以降低IFN-γ的表達水平(P值均為 P＜0.001)，見圖2。其次，我們用流式細胞術檢測IFN-γ蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)，與poly I:C組相比，E2聯(lián)合poly I:C組在8小時，可以顯著降低 IFN-γ的表達水平(P＜0.001)，在12小時和24小時，同樣降低IFN-γ的表達，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖3。接下來，我們用酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測IFN-γ的表達情況，發(fā)現(xiàn)與poly I:C組相比，E2聯(lián)合poly I:C處理組在8小時，可以顯著降低 IFN-γ的表達水平(P＜0.001)，而在其他時間點，并沒有變化(圖4)。綜上表明，E2能夠抑制NK92細胞IFN-γ的表達。

2.3 E2調節(jié)NK92細胞中miR-29b的表達 進一步，我們探討E2能否調節(jié)NK92中miR-29b的表達。為此，我們將NK92細胞用E2分別處理4、8、12和24小時，然后用定量RT-PCR檢測miR-29b的變化。結果表明，與對照組相比，在4、8和12小時時間點，poly I:C組中的miR-29b表達水平顯著下降(P值均為P＜0.001)，而 E2處理組無明顯變化(P＞0.05)。同時發(fā)現(xiàn)，與poly I:C組相比，E2和poly I:C聯(lián)合刺激后，NK92中miR-29b的表達量顯著升高(P值分別為 P＜0.01、P＜0.001、P＜0.05)，見圖5，也就是說E2逆轉了poly I:C處理后NK92中 miR-29b的表達。以上提示 E2可能對NK92細胞中miR-29b表達起一定的調控作用。

圖5 qRT-PCR檢測E2和或poly I:C處理NK92細胞不同時間后miR-29b分子的表達Fig.5 qRT-PCR analysis the section of NK92 miR-29b treated by E2 and or poly I:C at different time

圖6 PCR擴增IFN-γ 3'UTR 電泳圖及pEGFP-IFN-γ 3'UTR重組質粒酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.6 PCR amplification of IFN-γ 3'UTR and restriction enzyme analysis of pEGFP-IFN-γ 3'UTR recombinant plasmid

2.4 IFN-γ是miR-29b的靶基因 以上結果提示我們，E2處理NK92細胞后，IFN-γ的變化與miR-29b存在著負相關，那么，miR-29b是否調節(jié)IFN-γ的分泌呢?我們通過靶基因預測網(wǎng)站(http://www.targetscan.org， http://pictar.bio.nyu.edu， http://microrna.sanger.ac.uk)來尋找miR-29b潛在的靶基因，結果發(fā)現(xiàn)，三個網(wǎng)站中都預測到IFN-γ 3'UTR序列上含有miR-29b的結合位點。為了證明IFN-γ是否是miR-29b確切的靶基因，我們構建含有IFN-γ 3'UTR片段的重組質粒pEGFP-C1。以人基因組DNA為模板進行IFN-γ 3'UTR對應的基因組片段擴增，PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，在583 bp左右處有一清晰特異擴增條帶，其大小與預計長度相符(圖6)。同時將構建好的重組質粒進行HindⅢ及EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，雙酶切得到583 bp大小目的片段和4.7 kb大小的載體，所得片段大小與預期相符(圖6)。同時，我們將構建的重組質粒送交基因公司測序，結果證實所克隆的基因片段為 IFN-γ 3'UTR。綜上，我們重組的質粒構建正確。進一步，我們轉染重組質粒與miR-29b前體片段pre-miR-29b以及無義片段pre-nc至293A細胞中。48小時后，流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，與轉染無義片段相比，轉染pre-miR-29b后，綠色熒光蛋白表達強度顯著下降(P＜0.01，圖7)。結果證明，miR-29b能夠調節(jié)其靶基因IFN-γ的表達。

圖7 流式細胞術檢測293A細胞中綠色熒光蛋白的表達情況Fig.7 FCM analysis of green fluorescent protein in 293A cell

3 討論

雌激素能夠影響NK細胞的表型與功能，表現(xiàn)出重要的免疫調節(jié)作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)E2可能是通過影響NK細胞的表型分子(CD69、CD122、CD94和LY49)以及細胞因子IFN-γ的表達來抑制細胞的細胞毒作用和增殖能力［5］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)E2能夠降低人自然殺傷細胞株NK92細胞分泌的IFN-γ水平，提示雌激素在NK細胞免疫功能的發(fā)揮方面扮演著重要的角色。

microRNA作為一種重要的調節(jié)分子，不僅在腫瘤發(fā)生及感染性疾病等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，而且在免疫細胞發(fā)育、免疫應答及免疫調節(jié)等過程中也扮演重要角色［18］。關于 NK細胞中 microRNA作用研究的報道較少。Bezman等［19］人通過去除NK細胞中Dicer或者Dgcr8分子的表達來分析在NK細胞發(fā)育、生存、活化及發(fā)揮功能過程中一些關鍵的microRNA的作用。曹雪濤課題組在《自然·免疫學》上發(fā)表文章稱微小RNA-29(miR-29)可通過直接調控γ干擾素的產(chǎn)生，從而影響機體抵御胞內細菌感染［20］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)先兆子癇患者microRNA表達譜以及雌激素表達水平異常，并通過基因本位論(gene ontology)進一步分析，揭示了在母胎界面表達豐富的miR-29b可能在免疫應答及信號轉導等生物學事件中扮演著重要的角色。另外，有研究報道，miR-29b分子對腫瘤細胞的增殖、浸潤及遷移方面發(fā)揮重要的調節(jié)作用［21］。但是，目前關于NK細胞對IFN-γ的表達影響是否受到胎盤中的雌激素和microRNA的調節(jié)尚不清楚。最新研究顯示在乳腺癌細胞，子宮內膜基質細胞以及平滑肌細胞和小鼠子宮中，雌激素是通過雌激素受體來調控microRNA的表達［22］。本研究發(fā)現(xiàn)雌激素能夠上調miR-29b的表達，繼而抑制Poly I:C誘導的NK92細胞中IFN-γ的分泌，從而為研究雌激素調控NK細胞免疫功能提供了一種新的理論依據(jù)。那么雌激素是否也是通過雌激素受體或者通過協(xié)同其他轉錄因子如c-myc來調控miR-29b的表達呢?這給我們提出了新的課題。

本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素能夠抑制NK92細胞的IFN-γ分泌，并且miR-29b調節(jié)其靶基因IFN-γ的表達，提示雌激素通過microRNA作為一種新的調節(jié)IFN-γ產(chǎn)生的手段，對妊娠過程中NK細胞免疫功能的發(fā)揮起著重要的作用，今后可能作為一個研究熱點。綜上所述，正常妊娠胎盤微環(huán)境中雌激素的變化可能影響了NK細胞中microRNA表達的失調，進而導致免疫功能的紊亂，最終引起了先兆子癇的發(fā)生。那么，探討雌激素以及microRNA對NK狀態(tài)和功能異常引發(fā)的病理性妊娠的機制，為從免疫學角度理解病理性妊娠提供了新的思路，有助于病理性妊娠免疫治療的研究。

4 小結

人自然殺傷細胞株NK92表達ERα和ERβ;E2抑制NK92細胞IFN-γ mRNA和蛋白水平的表達;E2調節(jié)NK92細胞miR-29b的表達水平;miR-29b能夠調節(jié)靶基因IFN-γ的表達。結果提示，妊娠過程中雌激素的變化導致NK細胞免疫功能的異常，推測可能是先兆子癇發(fā)病的機制之一。

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