骨髓造血細(xì)胞島在免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少患者中的異質(zhì)性研究①

孫黎飛 韓 冰 李 鋼 吳強(qiáng)強(qiáng) 郝紅峰 明 匯 張金標(biāo)

(解放軍第148醫(yī)院腫瘤中心，淄博255300)

幼紅細(xì)胞造血島(Erythroblastic islands，EI)增多是免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少(IRH/IRP)骨髓特征之一。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)該類患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)Coombs試驗(yàn)陽性，島中的巨噬細(xì)胞與幼紅細(xì)胞之間連接處有抗人球蛋白抗體沉淀，并有巨噬細(xì)胞吞噬幼紅細(xì)胞現(xiàn)象，所以提出IRP中的EI可能是該類患者骨髓幼紅細(xì)胞“原位溶血”的重要原因［1，2］。為了進(jìn)一步研究IRH/IRP血細(xì)胞破壞和減少的免疫機(jī)制，本文觀察了骨髓涂片中出現(xiàn)“造血細(xì)胞島”(Hematopoietic islands，HI)現(xiàn)象的 IRH/IRP病例，結(jié)合患者相關(guān)免疫指標(biāo)，分析HI異質(zhì)性的可能原因，探討IRH/IRP發(fā)病的相關(guān)免疫機(jī)制及臨床意義。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 106例IRH/IRP(排除再生障礙性貧血、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿和骨髓增生異常綜合征)患者骨髓片均采自我院自2008年以來初診的患者，常規(guī)瑞氏染色法篩選出37例伴有造血細(xì)胞島(HI)現(xiàn)象的骨髓片進(jìn)行研究。其中血沉和/或IgG升高者12例，血清HLA-B27抗原升高者6例，血沉、IgG和血清HLA-B27抗原同時(shí)升高患者14例，HLA-B27抗原、血沉及IgG均不升高IRH/IRH患者5例。患者首次外周血Coombs試驗(yàn)均為陰性，3例經(jīng)糖皮質(zhì)激素等藥物治療后三系正常，因感染導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，復(fù)查Coombs直接試驗(yàn)轉(zhuǎn)為陽性。

1．2 方法

1．2．1 骨髓片細(xì)胞化學(xué)染色 常規(guī)聯(lián)苯胺法行過氧化物酶(POX)染色，觀察患者HI中粒細(xì)胞和免疫細(xì)胞POX表達(dá)情況;亞鐵氰化鉀法行鐵染色，觀察HI中巨噬細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞(APC)漿內(nèi)鐵染色狀態(tài)。

1．2．2 骨髓細(xì)胞MHCⅡ類分子HLA-DR抗原檢測 一抗羊抗人HLA-DR單克隆抗體、羊抗人補(bǔ)體抗體購自美國Beyotime公司，免疫化學(xué)堿性磷酸酶法染色試劑盒購自北京中杉金橋公司，參照試劑盒說明書步驟操作，Olympus BX40雙目顯微鏡(日本Olympus公司)觀察患者骨髓片中HI的免疫細(xì)胞胞漿內(nèi)HLA-DR抗原(MHCⅡ類分子基因產(chǎn)物)表達(dá)情況。

1．2．3 免疫熒光法(IF)觀察HI中抗人球蛋白抗體表達(dá) 羊抗人IgG抗體、Cy3標(biāo)記驢抗羊IgG熒光二抗IF固定液、熒光二抗稀釋液、熒光染色封閉液、熒光染色洗滌液均購自美國Beyotime公司，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作。Olympus BX51熒光顯微鏡觀察患者HI中造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞胞漿內(nèi)熒光抗體表達(dá)強(qiáng)度。營養(yǎng)性貧血骨髓片作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2．1 造血細(xì)胞島的異質(zhì)性 在紅細(xì)胞破壞嚴(yán)重的IRH/IRP患者骨髓片中，單純紅細(xì)胞克隆的幼紅細(xì)胞造血島多見，除此之外還伴有一些幼紅細(xì)胞、幼粒細(xì)胞和幼紅幼粒細(xì)胞型的HI。島中的免疫細(xì)胞和血細(xì)胞成分各異(如表1所示)。我們根據(jù)形態(tài)及功能學(xué)，將其主要分為以下幾種:

2．1．1 ADCC型HI37例患者骨髓中檢出ADCC型HI 21例(21/37，56．75%)。該型HI中的造血細(xì)胞多為幼紅細(xì)胞，三系嚴(yán)重降低的IRP患者骨髓中可出現(xiàn)幼粒細(xì)胞島和幼紅幼粒細(xì)胞島。島中免疫細(xì)胞為早幼粒、中幼粒、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞(圖1A1～A3)，這些細(xì)胞的POX染色，依其生物學(xué)性質(zhì)表現(xiàn)為弱陽性～陽性(圖1A2)，細(xì)胞膜上不表達(dá)MHCⅡ類分子，但幼紅細(xì)胞表面補(bǔ)體抗體陽性(圖1A4)?？谷薎gG抗體IF可見幼紅、幼粒細(xì)胞膜上存在強(qiáng)陽性的紅色熒光，而島中的免疫細(xì)胞胞漿周圍與造血細(xì)胞接觸處呈顆粒狀強(qiáng)陽性表達(dá)(圖1A5)，呈現(xiàn)出抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(Antibody dependent cell cytotoxicity，ADCC)現(xiàn)象。

2．1．2 巨噬細(xì)胞(Mφ)型HI 該型 HI在 IRH/IRP患者骨髓片中最多見，共檢出 26例(26/37，70．27%)，常與ADCC型HI同時(shí)出現(xiàn)。島中的Mφ呈活化狀態(tài)，并有吞噬血細(xì)胞現(xiàn)象(圖1B1)，POX染色陰性(圖1B2)，鐵染色可見Mφ吞噬鐵顆粒(圖1B3)。Mφ膜上HLA-DR抗體部分呈陰性表達(dá)(圖1B4)，而伴有感染的IRP患者M(jìn)φ則呈陽性表達(dá)。IF染色可見幼紅細(xì)胞膜周圍呈均勻陽性表達(dá)，島中Mφ與幼紅細(xì)胞相連的細(xì)胞漿內(nèi)可見到團(tuán)塊狀強(qiáng)陽性紅色熒光顆粒(圖1B5)。

2．1．3 抗原提呈型HI 在37例骨髓涂片中檢出12例(32．43%)有抗原提呈型HI。該型HI中造血細(xì)胞為幼紅和POX活性顯著減弱的幼粒細(xì)胞，抗原提呈細(xì)胞(APC)為 Mφ(圖1C1)和 DC(圖1C2)，APC的POX(圖1C1～C2)和鐵染色均為陰性(圖1C3)，胞漿HLA-DR強(qiáng)陽性(圖1C4)表達(dá)。IF顯示幼紅、粒細(xì)胞膜周圍和漿內(nèi)抗人IgG抗體陽性，APC漿內(nèi)可見到大量強(qiáng)陽性的紅色顆粒(圖1C5)。此外，此型患者骨髓片上活化狀態(tài)的淋巴細(xì)胞增多，淋巴細(xì)胞(CTL)攻擊粒細(xì)胞、幼紅細(xì)胞和血小板等靶細(xì)胞現(xiàn)象多見(圖1C6)，提示細(xì)胞免疫活化［1，3］。

表1 造血細(xì)胞島的異質(zhì)性Tab．1 The heterogeneity of HI

2．1．4 漿細(xì)胞型HI 在6例血沉顯著升高(ESR＞100 mm/h)，伴有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等多種自身免疫性疾病的重癥IRP患者骨髓中檢出漿細(xì)胞型HI(圖1D1)。該類患者骨髓片中可見到較多同時(shí)出現(xiàn)的ADCC型和Mφ型HI。島中的漿細(xì)胞表面抗人IgG熒光抗體呈強(qiáng)陽性表達(dá)，幼紅細(xì)胞則呈均勻陽性表達(dá)(圖1D2)，其中2例患者成熟紅細(xì)胞也呈強(qiáng)陽性，漿細(xì)胞和紅細(xì)胞之間有強(qiáng)陽性抗體粘連帶(未顯示)。

2．1．5 幼粒細(xì)胞型HI 在伴有HLA-B27增高和粒細(xì)胞嚴(yán)重減少的IRH/IRP患者骨髓中有4例出現(xiàn)幼粒細(xì)胞型HI(圖1E1)。島中的幼粒細(xì)胞漿多有空泡變性，POX表達(dá)顯著減弱，免疫細(xì)胞多為體積較小的DC?？谷薎gG免疫熒光染色可見幼粒細(xì)胞漿中呈均勻紅色顆粒狀陽性表達(dá)(圖1E2)。

圖1 造血細(xì)胞島細(xì)胞化學(xué)、免疫化學(xué)和免疫熒光染色結(jié)果(×1 000)Fig．1 Cytochemistry，Immunochemistry and Immunofluorescence staining of Hematopoietic islands(×1 000)

2．2 造血細(xì)胞島在骨髓中分布的異質(zhì)性與疾病相關(guān)聯(lián) 不同類型的造血細(xì)胞島在IRH/IRP患者骨髓中出現(xiàn)的種類和數(shù)量不盡相同，并且與患者的病情有一定的關(guān)聯(lián)。37例IRH/IRP患者骨髓中以Mφ型HI最多見，且多與ADCC型HI同時(shí)出現(xiàn)在血沉增高的患者骨髓涂片中。12例抗原提呈型HI中有7例出現(xiàn)在HLA-B27和血沉均升高的IRP患者骨髓涂片中，3例為單純HLA-B27升高者，2例出現(xiàn)在HLA-B27和血沉均陰性的骨髓涂片中。而6例漿細(xì)胞型HI中有3例與ADCC型HI、Mφ型HI和抗原提呈型HI同時(shí)出現(xiàn)在重度IRP患者骨髓片中，且此類患者多伴有多種自身抗體的產(chǎn)生，病情重、易反復(fù)，在血象恢復(fù)后，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑維持治療的時(shí)間也較長。

3 討論

通常認(rèn)為經(jīng)典的幼紅細(xì)胞島“EI”是指紅細(xì)胞在骨髓分化發(fā)育過程中，幼紅細(xì)胞圍繞巨噬細(xì)胞形成的特殊的造血龕，龕中的巨噬細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，為幼紅細(xì)胞提供生長微環(huán)境的同時(shí)，調(diào)節(jié)著幼紅細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，并且是幼紅細(xì)胞鐵來源的主要途徑，是幼紅細(xì)胞生長發(fā)育的輔助場所。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少(IRH/IRP)患者骨髓中出現(xiàn)的EI，存在巨噬細(xì)胞吞噬幼紅細(xì)胞現(xiàn)象，這些被吞噬的幼紅細(xì)胞的膜表面存在抗人IgG抗體，由此推斷此類“EI”現(xiàn)象是幼紅細(xì)胞在骨髓中“原位溶血”的重要原因［4-6］。

我們的研究結(jié)果顯示，IRH/IRP患者骨髓涂片出現(xiàn)的這種“EI”現(xiàn)象多發(fā)生嚴(yán)重的溶血現(xiàn)象，在伴有IgG和血沉顯著增高的患者中，既存在與造血細(xì)胞破壞過多反饋性刺激幼紅細(xì)胞生成加速的“幼紅細(xì)胞克隆”和“幼紅細(xì)胞造血島”現(xiàn)象，同時(shí)還存在各種以不同免疫細(xì)胞為中心的幼紅細(xì)胞島、幼粒細(xì)胞島、幼紅幼粒細(xì)胞島。這些形式各異的造血細(xì)胞島中的免疫細(xì)胞，發(fā)揮不同的免疫效應(yīng)，有別于經(jīng)典的EI，因此將其稱為“造血細(xì)胞島”(Hematopoietic islands，HI)或“免疫相關(guān)性造血細(xì)胞島”(Immunorelated hematopoietic islands，IRHI)更為合適。

免疫熒光染色(IF)發(fā)現(xiàn)37例IRH/IRP患者骨髓涂片中HI血細(xì)胞膜上抗人IgG抗體均為陽性的紅色熒光，島中的免疫細(xì)胞以粘附、捕獲和吞噬等不同的形式與抗人IgG陽性的造血細(xì)胞接觸(它們之間產(chǎn)生了不同形式的強(qiáng)陽性紅色抗人IgG抗體熒光顆粒)，發(fā)揮免疫介導(dǎo)和/或免疫效應(yīng)機(jī)制。這表明造血細(xì)胞膜抗原結(jié)構(gòu)改變，使得機(jī)體產(chǎn)生抗人IgG抗體，在不同的致病因素刺激下，免疫細(xì)胞活化對(duì)病變的造血細(xì)胞的攻擊，是IRH/IRP產(chǎn)生HI現(xiàn)象的重要因素，亦是IRH/IRP發(fā)病的免疫機(jī)制之一。

在IRH/IRP疾病的發(fā)生過程中，由于各種致病因素致使造血細(xì)胞膜抗原結(jié)構(gòu)改變，成為自身抗原激活B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體啟動(dòng)體液免疫應(yīng)答和ADCC作用的同時(shí)啟動(dòng)樹突狀細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞(Mφ)對(duì)造血細(xì)胞膜上自身抗原的識(shí)別、粘附、捕獲、吞噬，誘導(dǎo)特異性CTL活化，啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，這一過程在細(xì)胞因子構(gòu)成的免疫網(wǎng)絡(luò)刺激下相輔相成。

NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等免疫(效應(yīng))細(xì)胞的表面存在FcR受體，可通過與造血細(xì)胞表面的抗人IgG的重鏈Fc段結(jié)合而活化，引發(fā)一系列的細(xì)胞反應(yīng)，如吞噬免疫復(fù)合物、產(chǎn)生氧化爆發(fā)反應(yīng)、釋放各種裂解活性的酶和細(xì)胞因子，殺傷造血細(xì)胞。因此，在ADCC型HI中，中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的POX強(qiáng)陽性，而島中的粒細(xì)胞則由于病變POX活性減弱。NK和粒細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，不具備抗原提呈能力，故而不表達(dá)MHCⅡ類分子HLA-DR 抗原［1］。

由于Mφ既具備抗原提呈細(xì)胞(APC)的特性，又具備吞噬病原體和病變靶細(xì)胞的免疫效應(yīng)細(xì)胞功能，所以它不但是體內(nèi)發(fā)揮細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞，而且也是IRH/IRP一類自身免疫性疾病對(duì)機(jī)體造成損傷的重要效應(yīng)細(xì)胞。IF染色顯示巨噬細(xì)胞型HI內(nèi)Mφ和造血細(xì)胞接觸處存在粗大的強(qiáng)陽性抗人IgG紅色熒光，結(jié)合細(xì)胞化學(xué)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色，均顯示了巨噬細(xì)胞具有APC和吞噬功能效應(yīng)細(xì)胞的兩種不同生物學(xué)特征［1］。由此推斷表達(dá)HLADR抗原的Mφ型HI是Mφ發(fā)揮吞噬作用的HI，而POX弱陽性或陽性、不表達(dá)HLA-DR抗原的巨噬細(xì)胞型HI則應(yīng)屬于發(fā)揮ADCC作用效應(yīng)細(xì)胞。

抗原提呈(AP)型HI中DC和Mф高表達(dá)HLADR，IF染色清晰地展示了APC細(xì)胞漿中捕獲的強(qiáng)陽性抗人IgG紅色熒光顆粒，進(jìn)一步詮釋和證實(shí)了AP型HI在IRH/IRP發(fā)病中的免疫機(jī)制。血沉顯著升高伴有MHCⅠ類分子基因產(chǎn)物HLA-B27抗原升高的IRH/IRP患者骨髓片中，除出現(xiàn)分泌型漿細(xì)胞HI外，還伴有大量淋巴細(xì)胞(CTL)攻擊幼紅幼粒細(xì)胞和血小板的現(xiàn)象，提示患者體內(nèi)存在體液免疫活化和細(xì)胞免疫免疫應(yīng)答的雙重?fù)p害［2，3］。故此類患者病情重，單純糖皮質(zhì)激素治療難以奏效，須聯(lián)合能抑制Th細(xì)胞增殖和活化的CsA。

綜上所述，我們的研究表明IRH/IRP造血細(xì)胞島的異質(zhì)性是機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫針對(duì)骨髓造血細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)變異，產(chǎn)生抗人IgG導(dǎo)致的病理性改變，在疾病的不同階段由不同免疫效應(yīng)細(xì)胞所表現(xiàn)的不同免疫應(yīng)答狀態(tài)。本研究反映了IRH/IRP疾病的體液免疫和細(xì)胞免疫免疫活化狀態(tài)的異質(zhì)性和關(guān)聯(lián)性。我們認(rèn)為在IRH/IRP中出現(xiàn)的HI與經(jīng)典的“幼紅細(xì)胞島”有著本質(zhì)的差異，是該類疾病骨髓造血細(xì)胞原位破壞的主要因素。同一骨髓片出現(xiàn)的不同造血細(xì)胞島的形式和數(shù)量，是患者體內(nèi)體液免疫和細(xì)胞免疫活化的不同程度對(duì)造血細(xì)胞多重性損傷的生物學(xué)表現(xiàn)。

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