IL-1β和IL-18在鼠巨細(xì)胞病毒播散性感染中的表達(dá)及意義①

李旭芳 劉玲玲 劉興樓 舒賽男 李 革 方 峰

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，武漢430030)

人巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)在我國(guó)感染率很高，由于CMV是一種弱致病因子，多數(shù)感染者無癥狀或潛伏感染，但在免疫功能下降或缺陷時(shí)可引起疾?。?］。胎兒和新生兒全身播散性感染可致頭小畸形、智力障礙、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和神經(jīng)性耳聾、室間隔缺損等畸形;器官移植、艾滋病及其他免疫缺陷患者，可增加病死率和器官移植排斥率。迄今的研究證實(shí)病毒誘生的細(xì)胞因子在CMV致病性中發(fā)揮了重要作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子與CMV感染密切相關(guān)，如IL-6、IL-8、TNF、IFN及MIP-1α等［2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)的炎性體能夠識(shí)別病原微生物后活化，使 procaspase-1轉(zhuǎn)化為活性形式caspase-1，并促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟釋放［3-7］，這兩種細(xì)胞因子主要參與多種自身免疫性疾病的炎性損傷過程并介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答［8］。本研究旨在證實(shí)鼠CMV(Murine cytomegalovirus，MCMV)感染后炎性體活化并促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟釋放，為探尋多靶點(diǎn)抗CMV感染的治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，4周齡，購(gòu)自湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物室潔凈層柜內(nèi)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3天。

1.2 病毒 MCMV Smith株(美國(guó)德克薩斯大學(xué)健康衛(wèi)生中心惠贈(zèng))在BALB/c小鼠唾液腺中增殖，唾液腺勻漿經(jīng)空斑試驗(yàn)測(cè)定病毒平均感染性滴度3×106PFU(plaque-forming unit)/ml。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為播散性感染組和模擬感染對(duì)照組各16只。播散性感染組接種含MCMV 5×103PFU的唾液腺勻漿0.2 ml，模擬感染對(duì)照組接種等量正常唾液腺勻漿［9］。感染后第0(接種前)、3、7和14天，各組分別隨機(jī)處死4只小鼠。乙醚麻醉，眼球摘除取血后斷頸處死，無菌分離血清及脾、肝、肺和唾液腺等組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，部分脾組織－80℃冰箱保存。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)檢測(cè)組織MCMV感染性滴度參照參考文獻(xiàn)［10］，采用本實(shí)驗(yàn)室自制的小鼠胚胎肺成纖維細(xì)胞作為敏感細(xì)胞，檢測(cè)MCMV感染后3、7和14天小鼠肝、肺和唾液腺組織中MCMV感染性滴度。檢測(cè)低限為0.2 PFU/mg組織(濕重)。

1.5 Western blot法檢測(cè)脾細(xì)胞中caspase-1表達(dá)將分離的感染后0、3、7、14天的脾組織經(jīng)蛋白裂解液裂解研磨后，應(yīng)用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定裂解上清中的蛋白濃度。各樣本取50 μg蛋白上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后用含0.05%Tween 20的TBS封閉2小時(shí)，分別用 caspase-1兔多克隆抗體(1∶400，BioVision 公司)及兔抗鼠GAPDH(1∶1 000，Santa Cruz公司)孵育過夜，羊抗兔結(jié)合HRP的特異性IgG二抗(1∶10 000，Santa Cruz公司)孵育 1小時(shí)后，化學(xué)發(fā)光法顯色曝光。采用HMIAS-2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)分析測(cè)定目的條帶的吸光值并分析與GAPDH條帶的相對(duì)吸光值。

1.6 ELISA法檢測(cè)血清IL-1β和IL-18水平 采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)感染后0、3、7和14天分離的血清中IL-1β和IL-18(R＆D Systems)濃度。

1.7 免疫組化法檢測(cè)組織中IL-1β和IL-18表達(dá)唾液腺、肺、肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟至水化后進(jìn)行以下操作:抗原熱修復(fù);0.3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶;正常小牛血清封閉20分鐘;分別加入抗鼠IL-1β(Peprotech公司，1∶100稀釋)和抗鼠 IL-18抗體(Biovision公司，1∶100稀釋)，4℃ 孵育過夜;加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠室溫孵育15分鐘;加入鏈霉素標(biāo)記的生物素蛋白孵育10分鐘;DAB顯色5～10分鐘;蘇木紫復(fù)染;1%鹽酸酒精分化后脫水透明，中性樹膠封片。應(yīng)用Olympus BX41顯微系統(tǒng)攝像。每個(gè)標(biāo)本選擇3張切片，每張切片選擇5個(gè)高倍鏡視野(×200)進(jìn)行觀察，對(duì)組織中IL-1β和IL-18陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行半定量分析，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以每高倍鏡視野中陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)表示(cells/hpf)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用Microsoft Excel軟件分析，計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCMV感染后組織病毒滴度 肝組織病毒滴度于MCMV感染后3天升高，其后迅速下降，14天即檢測(cè)不到;肺組織病毒滴度低于檢測(cè)低限，而唾液腺組織病毒滴度呈逐漸增高趨勢(shì)(圖1)。

2.2 Western blot法檢測(cè)脾細(xì)胞中caspase-1表達(dá)狀況 模擬感染對(duì)照組感染后procaspase-1和caspase-1的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定;與模擬感染對(duì)照組相比，播散性感染組感染后3天 procaspase-1和caspase-1的表達(dá)明顯升高［相對(duì)吸光值分別為(1.226±0.355)vs(0.361±0.033)，t=4.22，P ＜0.01和(1.193±0.165)vs(0.332 ±0.095)，t=7.84，P ＜0.01］，隨后逐漸恢復(fù)正常(圖2)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)檢測(cè)MCMV感染鼠組織病毒滴度Fig.1 The levels of viral titer in tissues of MCMV-infected mice quantified by standard plaque assay

2.3 血清中IL-1β和IL-18水平 模擬感染對(duì)照組血清IL-1β和IL-18水平相對(duì)穩(wěn)定;與模擬感染對(duì)照組相比，播散性感染組感染后3天血清IL-1β和IL-18明顯升高并達(dá)峰值［(分別為(112.72±5.20)vs(47.86±4.35)pg/ml，t=16.57，P ＜0.01和(42.74±4.23)vs(22.60 ±2.82)pg/ml，t=6.85，P ＜0.01］，隨后逐漸降至正常水平(圖3)。

2.4 免疫組化法檢測(cè)組織中IL-1β和IL-18表達(dá)模擬感染組和播散性感染組0天各組織中無IL-1β和IL-18陽(yáng)性細(xì)胞;而播散性感染組感染后3天唾液腺組織中可見少量IL-1β和IL-18陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，并呈進(jìn)行性增加，至感染后7天明顯增多達(dá)峰值，14天減少。而肺和肝組織僅于感染后3天可見少量陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，其后未見陽(yáng)性表達(dá) (圖4)。

圖2 Western blot檢測(cè)脾細(xì)胞中procaspase-1和caspase-1的表達(dá)狀況(A)及相對(duì)吸光值(B)Fig.2 The expressions of procaspase-1 and caspase-1 in spleen detected by Western blot(A)and the relative intensity(B)

圖3 ELISA法檢測(cè)血清中IL-1β(A)和 IL-18(B)水平Fig.3 The levels of IL-1β(A)and IL-18(B)in sera measured by ELISA

圖4 免疫組化法檢測(cè)組織中IL-1β(A)和IL-18(B)表達(dá)(×200)Fig.4 The expressions of IL-1β(A)and IL-18(B)in tissues detected by immunohistochemistry(×200)

3 討論

機(jī)體清除病原體的天然免疫應(yīng)答需要巨噬細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞募集到感染部位，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子［11］。MCMV能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中 AIM2(Absent in melanoma 2)炎性體介導(dǎo)的NF-κB和caspase-1的活化［12-14］。NF-κB 的活化能夠產(chǎn)生 TNF-α、IFN-γ等多種炎性因子，已有研究顯示這些炎性因子能夠明顯抑制肝細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制而不損傷肝細(xì)胞，主要介導(dǎo)肝細(xì)胞非損傷性抗細(xì)胞內(nèi)病毒效應(yīng)［15，16］。

本組實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MCMV感染后3天procaspase-1的募集及轉(zhuǎn)化為活性caspase-1增加，同時(shí)其下游的炎性因子IL-1β和IL-18在血清中的成熟釋放明顯增加，說明了MCMV感染后炎性體形成及活化增加。IL-1β最初是作為內(nèi)生致熱源被人們所認(rèn)識(shí)，其與發(fā)熱、感染及損傷密切相關(guān)，能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)和激活很多炎性分子，如磷酸酯酶A2、花生四烯酸環(huán)氧合酶(COX)等從而造成組織損傷;此外，IL-1R信號(hào)的表達(dá)有助于Th17細(xì)胞的增殖，還能夠通過直接增強(qiáng)B細(xì)胞的增殖或間接上調(diào)T細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)而增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答［17］。IL-18以往稱為IFN-γ誘導(dǎo)因子，主要增強(qiáng)Th1細(xì)胞的增殖及IFN-γ的產(chǎn)生;近年來的研究發(fā)現(xiàn)還能夠增強(qiáng)Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞表達(dá)Fas配體而介導(dǎo)細(xì)胞毒作用，上調(diào)NF-κB的表達(dá)和活性，增強(qiáng)其他促炎因子的產(chǎn)生，加重局部組織繼發(fā)性損傷［18］。這些研究說明 IL-1β和IL-18在機(jī)體的免疫反應(yīng)尤其是抗感染免疫中具有雙刃劍的作用。而本研究發(fā)現(xiàn)的IL-1β和IL-18在不同組織中的不均一性表達(dá)(尤其是唾液腺組織中明顯高表達(dá))至少部分說明了這兩種細(xì)胞因子作用的靶細(xì)胞可能不同于 TNF-α、IFN-γ等，在肝、肺等臟器的炎性損傷中發(fā)揮非主導(dǎo)作用，這可能是由于不同的細(xì)胞因子環(huán)境影響了不同的靶器官的炎性反應(yīng)及適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

MCMV播散性感染模型的建立有助于闡明MCMV感染后特殊的細(xì)胞因子在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的作用。IL-1β和IL-18具有明顯的促炎作用，而炎性體的活化、IL-1β和IL-18的產(chǎn)生又都是啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的信號(hào)［7］，因此，對(duì)于IL-1β和IL-18在MCMV播散性感染中病毒滴度最高的唾液腺組織中呈現(xiàn)的高表達(dá)與局部組織的炎性反應(yīng)及適應(yīng)性免疫應(yīng)答的相關(guān)性的深入研究，對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)多細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在MCMV感染致病性中的作用具有重要意義。

1 董永綏，方 峰.巨細(xì)胞病毒和巨細(xì)胞病毒感染的診斷［J］.中華兒科雜志，1999;37(7):397-398.

2 熊書君，方 峰.細(xì)胞因子與HCMV致病性關(guān)系初探［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)(病毒學(xué)分冊(cè))，2004;11(6):176-179.

3 Burckstummer T，Baumann C，Bluml S et al.An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome［J］.Nat Immunol，2009;10(3):266-272.

4 Fernandes-Alnemri T，Yu J W，Datta P et al.AIM2 activates the inflammasome and cell death in response to cytoplasmic DNA［J］.Nature，2009;458(7237):509-513.

5 Hornung V，Ablasser A，Charrel-Dennis M et al.AIM2 recognizes cytosolic dsDNA and forms a caspase-1-activating inflammasome with ASC［J］.Nature，2009;458(7237):514-518.

6 Roberts T L，Idris A，Dunn J A et al.HIN-200 proteins regulate caspase activation in response to foreign cytoplasmic DNA［J］.Science，2009;323(5917):1057-1060.

7 Van De Veerdonk F L，Netea M G，Dinarello C A et al.Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection［J］.Trends Immunol，2011;32(3):110-116.

8 Martinon F，Mayor A，Tschopp J.The inflammasomes:guardians of the body［J］.Annu Rev Immunol，2009;27:229-265.

9 徐 翼，方 峰，向稚丹 et al.小鼠巨細(xì)胞病毒全身播散型感染模型的建立［J］.臨床兒科雜志，2008;26(6):517-520.

10 徐 翼，方 峰，向稚丹et al.小鼠巨細(xì)胞病毒性心肌炎模型的建立［J］.中華心血管病雜志，2005;33(4):360-363.

11 Brodsky I E，Medzhitov R.Pyroptosis:macrophage suicide exposes hidden invaders［J］.Curr Biol，2011;21(2):72-75.

12 Hornung V，Latz E.Intracellular DNA recognition［J］.Nat Rev Immunol，2010;10(2):123-130.

13 Rathinam V A，Jiang Z，Waggoner S N et al.The AIM2 inflammasome is essential for host defense against cytosolic bacteria and DNA viruses［J］.Nat Immunol，2010;11(5):395-402.

14 Fernandes-Alnemri T，Yu J W，Juliana C et al.The AIM2 inflammasome is critical for innate immunity to francisella tularensis［J］.Nat Immunol，2010;11(5):385-393.

15 Cavanaugh V J，Guidotti L G，Chisari F V.Inhibition of hepatitis B virus replication during adenovirus and cytomegalovirus infections in transgenic mice［J］.J Virol，1998;72(4):2630-2637.

16 Luca F V，F(xiàn)rancis V C.Cytokine-induced viral purging-role in viral pathogenesis［J］.Current Opinion Microbiology，1999;2(4):388-391.

17 Patrick J S，Michael F M，Thirumala-Devi K.Inflammasomes and autoimmunity［J］.Cell，2011;17(2):57-64．

18 Fantuzzi G，Dinarello C A.Interleukin-18 and interleukin-1 beta:two cytokine substrates for ICE(caspase-1)［J］.J Clin Immunol，1999;19:1-11.