赭曲霉毒素A生成轉(zhuǎn)化及致毒機(jī)制的研究進(jìn)展

郝俊冉，許文濤，2，黃昆侖，2，*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083;2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京100083)

赭曲霉毒素A生成轉(zhuǎn)化及致毒機(jī)制的研究進(jìn)展

郝俊冉1，許文濤1，2，黃昆侖1，2，*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083;2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京100083)

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉屬(Aspergillus.sp)和青霉屬(Penicillium.sp)真菌產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，它的生成受溫度、水活度等的影響。檢測(cè)食品及飼料中OTA含量的基本方法有薄層層析法、高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法。OTA因被認(rèn)為與巴爾干半島腎病有關(guān)而引起全球的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，OTA具有腎毒性、肝毒性、免疫毒性、基因毒性等，并且主要是通過(guò)促進(jìn)膜的過(guò)氧化反應(yīng)，抑制線粒體的呼吸作用和影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中蛋白及關(guān)鍵因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)等來(lái)達(dá)到致毒效應(yīng)。吸附、轉(zhuǎn)化、降解是OTA脫毒的主要方式。本文就OTA的檢測(cè)方法、生物合成、致毒機(jī)制和脫毒轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

赭曲霉毒素A，檢測(cè)方法，生物合成，致毒機(jī)制，脫毒轉(zhuǎn)化

Abstract:As a secondary metabolite，ochratoxin A(OTA)was a mycotoxin produced by fungi of two genera:Aspergillus and Penicillium，and its production was influenced by temperature and water activity，etc.The basic methods for determination of ochratoxin A content in food or feed samples were Thin-layer chromatography(TLC)，High-performance liquid chromatography(HPLC)and Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).OTA was first grabbed global attention and concern for the hazard and impact that might account for the“Balken Endemic Nephropathy”(BEN).Moreover，researches had shown that:OTA was nephrotoxic，hepatotoxic，immunotoxic and genetoxic mainly through promotion of membrane peroxidation，inhibition of mitochondrial respiration and affect on the expression of some important protein or transcription factors in the signal transduction，etc.The main means to detoxify OTA were adsorption，transformation and degradation.Here，some advances on the determination and the mechanism of biosynthesis，toxicity，detoxification and biotransformation of ochratoxin A had been reviewed.

Keywords:ochratoxin A(OTA);determination;biosynthesis;mechanism oftoxicity;detoxification and biotransformation

赭曲霉毒素 A(mycotoxin ochratoxin A，OTA)是由青霉屬(Penicillium.sp)和曲霉屬(Aspergillus.sp)真菌產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，許多研究人員認(rèn)為OTA是導(dǎo)致上世紀(jì)五十年代巴爾干半島地方性腎病的主要原因，并且已從人的血清［1］、尿［2］等中檢測(cè)到OTA。研究還發(fā)現(xiàn)，OTA具有腎毒性、肝毒性、基因毒性、致畸性、胚胎毒性等，毒性僅次于黃曲霉毒素，在赭曲霉毒素中毒性最強(qiáng)。OTA在1993年被IARC劃為2B類(lèi)致癌物。誘導(dǎo)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路等是OTA致毒的可能途徑。OTA的穩(wěn)定性強(qiáng)、不易降解，廣泛存在于糧食、飼料和糧谷類(lèi)食物等中，動(dòng)物食用了含有OTA的飼料還會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)殘留從而使動(dòng)物制品被污染，這些殘留的OTA可以經(jīng)由食物鏈進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，危害他們的健康［3］。OTA污染糧食與飼料是全球糧食、畜牧業(yè)生產(chǎn)與加工所面臨的一個(gè)重要問(wèn)題。因此，明確OTA的生成機(jī)制，建立完善有效的檢測(cè)方法，進(jìn)一步研究OTA的致毒機(jī)制，開(kāi)發(fā)高效環(huán)保的脫毒方法是必要而緊迫的，這對(duì)提高糧食質(zhì)量、保障人類(lèi)及動(dòng)物健康具有重要意義。

1 赭曲霉毒素A的理化性質(zhì)

OTA結(jié)構(gòu)式為7-羥基-5-氯-3，4，二氫-8-羥基-3-甲基異香豆素-7β-苯丙氨酸(圖1)，分子式為C20H18O6NCl，分子量為403.8。OTA是無(wú)色結(jié)晶化合物，在極性有機(jī)溶劑中高度可溶，微溶于水，溶于碳酸氫鈉水溶液［4］。由于苯基丙氨酸部分的羰基和異香豆素部分的酚式羥基，OTA的酸度系數(shù)pKa范圍分別為4.2～4.4和7.0～7.3。OTA從苯和二甲苯中再結(jié)晶時(shí)熔點(diǎn)分別為90℃和171℃，在96%乙醇中最大發(fā)射熒光是在467nm，在純乙醇中則為428nm［5-6］。

圖1 赭曲霉毒素A的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of OTA

2 赭曲霉毒素A的檢測(cè)方法

檢測(cè)食品及飼料中OTA含量的基本方法有薄層層析法(Thin-layer chromatography，TLC)、高效液相色譜法(High-performance liquid chromatography，HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。這幾種方法各有利弊，且不斷進(jìn)行改進(jìn)以滿足實(shí)際需求。

2.1 薄層層析法(Thin－layer chromatography，TLC)

薄層層析法是較早應(yīng)用于OTA檢測(cè)的一種方法，具體方法是:用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇-水提取樣品中的OTA，提取液經(jīng)液液分析后，根據(jù)其在365nm紫外光燈下產(chǎn)生的黃綠色熒光，在薄層色譜板上與標(biāo)準(zhǔn)品比較測(cè)定含量。薄層層析法可以進(jìn)行毒素的定量和半定量檢測(cè)，廉價(jià)、易操作，能夠很容易的識(shí)別目標(biāo)物質(zhì)［7］，但是需要很好的了解樣品的性質(zhì)以進(jìn)行樣品前處理，存在靈敏度較差、耗時(shí)、試劑繁多、重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)，已不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)的需求［8］。

2.2 高效液相色譜法(High－performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC法檢測(cè)OTA是使用較多且被國(guó)際社會(huì)所認(rèn)可的檢測(cè)方法，具有較高的靈敏度，可精確地對(duì)樣品中的OTA進(jìn)行定性、定量分析，但儀器價(jià)格昂貴，對(duì)樣品的前處理要求高。近幾年高效液相色譜法與熒光檢測(cè)器、質(zhì)譜(Mass spectrometry，MS)、電噴霧電離的串聯(lián)質(zhì)譜(Electrospraytandem mass spectrometry，ESI-MS/MS)等方法聯(lián)合使用使得OTA的檢測(cè)更為方便和靈敏。

目前，對(duì)酒中OTA的檢測(cè)應(yīng)用最廣的方法就是帶有熒光檢測(cè)器的高效液相色譜法，在檢測(cè)前要經(jīng)歷免疫親和除雜步驟。這種方法最早是Visconti等［9］報(bào)道的。Al-Hazmi應(yīng)用帶有熒光檢測(cè)器的HPLC法結(jié)合免疫親和層析柱分析了蘋(píng)果汁中OTA的侵染情況［10］。Bento等則應(yīng)用此方法對(duì)葡萄牙某些地區(qū)的小麥面包進(jìn)行了 OTA檢測(cè)［11］。Remiro等［12］還應(yīng)用帶有熒光檢測(cè)器的HPLC，通過(guò)免疫親和性管柱分離純化第一次實(shí)現(xiàn)了紅酒中OTA及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物(OTB、OTC等)共現(xiàn)，并進(jìn)行了同時(shí)定量。這也為毒素檢測(cè)提供了一種新思路。

由于高效液相色譜法和以前使用的薄層色譜法在檢測(cè)前均需要較長(zhǎng)時(shí)間的樣品除雜，如液-液分流，固相抽提等，因此簡(jiǎn)化除雜方法使OTA的定量選擇性和靈敏性更高成為研究熱點(diǎn)。Ghali等［13］應(yīng)用免疫親和柱-高效液相色譜法(IAC-HPLC)對(duì)突尼斯180份食物樣本進(jìn)行OTA分析，樣品萃取采用氰化甲烷/水(80∶20，v/v)，并通過(guò)免疫親和性管柱進(jìn)行純化。使用氰化甲烷和酸化的水(2%的醋酸)作為流動(dòng)相并根據(jù)阻滯時(shí)間不同進(jìn)行樣品分離，重現(xiàn)性很好，310nm激發(fā)波、465nm發(fā)射波時(shí)，監(jiān)測(cè)和定量限分別為0.lng/mL和 0.2ng/mL，只需要10g樣品即可進(jìn)行OTA分析，簡(jiǎn)化了除雜、液液分流、IAC清除等步驟，并且脫脂步驟中乙烷的使用等使得到的色譜圖更單一可信。

除此之外，Afsah-Hejri等［14］還針對(duì)花生中 OTA的HPLC檢測(cè)定量條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以下條件效果最好:流動(dòng)相為5mmol/L的乙酸鈉(乙酸將pH調(diào)至2.36)/ACN/MeOH(40∶30∶30);激發(fā)波為 333nm;發(fā)射波為467nm;24℃，流速為0.4mL/min，檢測(cè)限為0.05ng/g。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(immunochemical enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA的原理是:在合適的載體上，酶標(biāo)記的抗體(抗原)與相應(yīng)的抗原(抗體)形成復(fù)合物，在酶底物存在時(shí)，復(fù)合物上的酶催化底物使其顯色。在一定條件下，酶降解底物程度和顏色深淺是成一定關(guān)系的，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定OD值即可計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的含量。

ELISA的核心反應(yīng)為抗原抗體的特異結(jié)合，只需要較小體積的樣品且樣品除雜較快。因此ELISA簡(jiǎn)單、快速、特異性好、靈敏度高，對(duì)樣品中OTA凈化純度要求不高，能同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品定性或定量檢測(cè)，適于OTA批量檢測(cè)。但是相對(duì)于層析法，有時(shí)ELISA會(huì)產(chǎn)生系統(tǒng)的高偏差，抗體經(jīng)常對(duì)與毒素相似的物質(zhì)表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性能，造成假陽(yáng)性［15］，檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性差，酶穩(wěn)定性差，因此一般需用其它方法驗(yàn)證。Flajs等［16］對(duì)來(lái)自克羅地亞的紅酒和葡萄汁樣品進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附和高效液相色譜法分析發(fā)現(xiàn)這兩種方法對(duì)OTA自然污染的酒樣的分析結(jié)果關(guān)聯(lián)性很好(r=0.821)，OTA濃度較高時(shí)關(guān)聯(lián)性則更好，但是與高效液相色譜法相比酶聯(lián)免疫吸附在檢測(cè)非常低濃度的OTA時(shí)則重復(fù)性差，效果不好。

除上述三種基本方法之外，用于OTA檢測(cè)的方法還有免疫親合柱―熒光光度法、時(shí)間分辨熒光免疫法、膠體金免疫層析技術(shù)和免疫傳感器法等。此外，越來(lái)越多新的檢測(cè)方法的出現(xiàn)為快速高效檢測(cè)樣品中的OTA提供了可能性。Zamfir等［17］近期利用高靈敏性的、不需要標(biāo)簽的、有磁性的納米粒子分別與電化學(xué)阻抗光譜EIS和表面等離子共振SPR結(jié)合形成生物傳感器來(lái)檢測(cè)樣品中的OTA含量。發(fā)現(xiàn)前者檢測(cè)限為0.01ng/mL靈敏性較好，后者檢測(cè)范圍較大為1～50ng/mL，并且得到的結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附試劑盒結(jié)果一致，檢測(cè)效果很好。

3 赭曲霉毒素A的生成機(jī)制及影響因素

目前對(duì)于OTA的生成機(jī)制已經(jīng)有一定的結(jié)果，因此，近幾年的研究重點(diǎn)就集中在影響OTA產(chǎn)量的菌株、生態(tài)生理學(xué)影響等方面。

3.1 赭曲霉毒素A的生成機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，OTA的苯基丙氨酸部分來(lái)自于莽草酸途徑，二氫異香豆素部分來(lái)自于聚五酮途徑。異香豆素聚酮化合物合成的第一步是一個(gè)乙酸鹽基團(tuán)和四個(gè)丙二酸鹽基團(tuán)縮合在一起，該步反應(yīng)需要聚酮合成酶的活化。聚酮化合物長(zhǎng)鏈經(jīng)過(guò)形成內(nèi)酯環(huán)和羰基化修飾，并由氯化物過(guò)氧化物酶將氯原子加入形成OTα，最后，OTA合成酶催化OTα連到苯基丙氨酸，合成 OTA［18-23］。

3.2 影響赭曲霉毒素A產(chǎn)生的因素

3.2.1 產(chǎn)毒菌 OTA主要是由曲霉屬和青霉屬的某些真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，但是在不同的生態(tài)位中由于環(huán)境條件、受侵染谷物種類(lèi)不同，毒素爆發(fā)率及產(chǎn)毒菌的種類(lèi)是不同的，如Dachoupakan等［24］的研究就發(fā)現(xiàn)，在葡萄中黑曲霉(Aspergillus niger)的生長(zhǎng)與收獲區(qū)域和收獲年份有關(guān)?？傮w來(lái)說(shuō)，在涼爽環(huán)境下主要的OTA產(chǎn)毒菌是青霉屬真菌，在熱帶地區(qū)則主要為曲霉屬真菌。

產(chǎn)OTA的青霉屬真菌一般分為兩類(lèi)，一類(lèi)是Penicillium verrucosum主要污染谷物，Penicillium nordicum和一些通過(guò)蛋白食物發(fā)酵所得的產(chǎn)毒菌株則被劃為第二類(lèi)，主要在肉制品和奶酪中被發(fā)現(xiàn)。與P.verrucosum相比，P.nordicum菌株的OTA產(chǎn)量較低。這些青霉屬真菌一般分布于氣候涼爽的地域如北歐，加拿大等地。曲霉屬真菌中的 Aspergillus ochraceus是OTA的重要產(chǎn)生菌，在小麥、堅(jiān)果、咖啡以及加工肉類(lèi)以及煙熏的和鹽腌制的魚(yú)中常見(jiàn)。曲霉屬真菌產(chǎn)毒的第二類(lèi)是黑霉真菌，Aspergillus carbonarius是最主要的一種，Aspergillus niger則是熱帶和亞熱帶植物尤其是葡萄和干果中OTA的主要產(chǎn)生菌，但是A.niger只有一部分菌株可產(chǎn)OTA。近年來(lái)也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［25］，在可可豆中這兩種菌也可以產(chǎn)生OTA，但是產(chǎn)量較低。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)，Aspergillus alliaceus、 Aspergillus terreus、 Aspergillus fumigatus、Aspergillus versicolor等一些菌株也可以產(chǎn)生較低含量的 OTA［26］。

菌對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境有選擇性，對(duì)不同的農(nóng)產(chǎn)品也有不同的偏好性，農(nóng)產(chǎn)品中真菌菌群的組成和可能產(chǎn)生的毒素都將因?yàn)橘A藏時(shí)間和貯藏條件而發(fā)生改變。

3.2.2 生態(tài)生理學(xué)因素 溫度、水活度和培養(yǎng)基成分等，這些因素都會(huì)影響產(chǎn)毒菌的生理機(jī)能及產(chǎn)毒效率，目前關(guān)于此類(lèi)的研究較多。

P.verrucosum最佳生長(zhǎng)溫度是30℃，水活度為0.80，被認(rèn)為幾乎是谷物專(zhuān)一性的。Arroyo等［27］曾對(duì)面包中的P.verrucosum菌株進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)在水活度為0.93，pH為6時(shí)，生長(zhǎng)大約28～36d的菌株OTA產(chǎn)量最大。A.ochraceus和同屬的其他嗜溫種類(lèi)Aspergillus westerdijkiae、Aspergillus steynii均能產(chǎn)生金棕色的分生孢子。它們的適宜生長(zhǎng)溫度為24～31℃(8～40℃ 均可生長(zhǎng))，水活度為 0.95～0.99，pH 為3～10，有研究表明A.ochraceus中有些菌株在糧食中最適宜產(chǎn)毒條件為30℃，水活度為0.99［28］。Alborch等［29］在對(duì)玉米仁進(jìn)行研究表明:A.niger和 A.carbonarius適宜生長(zhǎng)溫度分別為 25～40℃和20～35℃，兩者在該溫度范圍內(nèi)均可產(chǎn)OTA，但是在15℃時(shí)均產(chǎn)量最高，后者在20℃時(shí)也可達(dá)到該產(chǎn)量，且在水活度為0.98時(shí)產(chǎn)量要明顯高于水活度為0.96和0.92。Esteban等［30］的實(shí)驗(yàn)也證明 A.carbonarius的一些菌株在15℃時(shí)OTA產(chǎn)量高于30℃。但是也有研究稱(chēng)，在水活度為0.973，25℃時(shí)，A.niger的OTA產(chǎn)量最大，A.carbonarius的適宜生長(zhǎng)溫度為25～35℃，產(chǎn)OTA的適宜溫度則為20℃和25℃。

對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，影響OTA的產(chǎn)生和產(chǎn)量最主要的原因是農(nóng)產(chǎn)品收獲時(shí)的環(huán)境，干燥條件及貯藏方式。谷物干燥的水分活度達(dá)到0.7以下，并且在貯藏過(guò)程中也保持該水平，能有效降低產(chǎn)毒菌的數(shù)量?；ㄉA藏時(shí)水活度保持在0.91以下則可以有效減少黑霉菌 OTA 的產(chǎn)量［31］。

除此之外，不同的農(nóng)產(chǎn)品因?yàn)樗瑺I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同，因此侵染的菌株也有差異，這也會(huì)對(duì)OTA的產(chǎn)生條件有一定的影響。

4 OTA的致毒機(jī)理研究進(jìn)展

目前的研究發(fā)現(xiàn)，OTA對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)具有腎毒性、肝毒性、免疫毒性、致畸性等［32］并且還具有植物毒性［33］，因此對(duì)于其致毒機(jī)理的研究是必要而緊迫的。研究發(fā)現(xiàn)，OTA能誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生、線粒體的結(jié)構(gòu)及功能的改變以及一系列生理生化介導(dǎo)因子表達(dá)的上調(diào)或者下降等，因此，研究者推測(cè)這些改變及其產(chǎn)生的一系列后續(xù)反應(yīng)都有可能是OTA致毒的原因。

4.1 活性氧產(chǎn)生及其毒性結(jié)果

某些外源物質(zhì)可以誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行從而能產(chǎn)生活性氧(ROS)，并能通過(guò)氧化還原敏感機(jī)制損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)基因表達(dá)從而引起氧化細(xì)胞損傷?；钚匝醯陌袠?biāo)是核酸、蛋白和脂質(zhì)，以及一些小的生物分子(抗壞血酸、生物胺等)。和這些外源物質(zhì)一樣OTA也能引起活性氧的生成，雖然OTA引起活性氧生成的生物機(jī)制仍然不是很明確，但是研究者普遍認(rèn)為活性氧可以通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化、降低抗氧化酶活性、誘導(dǎo)DNA損傷等在OTA的致毒中發(fā)揮重要作用。

通過(guò)體外對(duì)大鼠肝、腎細(xì)胞的研究以及在體實(shí)驗(yàn)，Rahimtula等［34］證明了OTA能增加脂質(zhì)過(guò)氧化，并認(rèn)為主要是由于促進(jìn)了依賴(lài)NADPH和抗壞血酸鹽的脂質(zhì)過(guò)氧化，而鐵離子(Fe3+)則是輔助因子。并且活性氧導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化等后果可能會(huì)使DNA損傷發(fā)生。韓薇等［35］對(duì)敘利亞倉(cāng)鼠腎細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)OTA能導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，彗星DNA含量和拖尾現(xiàn)象與OTA呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系，且經(jīng)OTA處理的細(xì)胞中過(guò)氧化物歧化酶活力顯著降低。研究者認(rèn)為OTA對(duì)腎細(xì)胞活力的影響與細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物的大量生成和抗氧化酶活力下降有關(guān)，且對(duì)細(xì)胞DNA造成損傷，引起細(xì)胞凋亡。通過(guò)中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢細(xì)胞(CHO)和人的淋巴干細(xì)胞(TK6)中對(duì)OTA誘導(dǎo)的微核和DNA損傷的對(duì)比研究，Ali等［36］發(fā)現(xiàn)OTA濃度為15μmol/L即能誘導(dǎo)微核體產(chǎn)生和亞二倍體發(fā)生。且隨濃度增加在兩種細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了DNA核苷酶(formamidopyrimidine-DNA glycosylase，fpg)敏感位點(diǎn)的增加，研究者認(rèn)為氧化的DNA損傷和OTA侵染之間的一致性說(shuō)明前者在OTA誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體斷裂和非整倍體中發(fā)揮作用。Sava等［37］則在對(duì)OTA神經(jīng)毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，OTA能誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化的DNA損傷，形成對(duì)腦部的氧化壓力，并嚴(yán)重消耗腦部的紋狀體多巴胺。

4.2 線粒體呼吸鏈的抑制

線粒體是細(xì)胞中非常重要的細(xì)胞器，實(shí)驗(yàn)證明，線粒體功能紊亂是OTA致毒的早期事件。OTA能夠抑制大鼠肝臟細(xì)胞的呼吸作用，導(dǎo)致ATP的消耗并對(duì)線粒體的形態(tài)有一定的影響。研究者認(rèn)為可能的機(jī)制為:OTA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制定位在線粒體內(nèi)膜上的載體蛋白，從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制，或者是OTA抑制琥珀酸鹽相關(guān)的電子活動(dòng)從而影響電子傳遞鏈［23］。

Bouaziz等［38］對(duì)人的肝癌細(xì)胞的研究認(rèn)為，OTA主要是誘導(dǎo)了依賴(lài)于半胱天冬酶(caspase)的線粒體的凋亡通路，OTA能激活Bax，使其移位到線粒體膜上，線粒體的跨膜電勢(shì)消失，PTPC打開(kāi)并釋放細(xì)胞色素c，這一系列反應(yīng)誘導(dǎo)了O2-的產(chǎn)生，最終誘發(fā)了一個(gè)依賴(lài)于p53蛋白的細(xì)胞凋亡通路，而線粒體則在OTA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了中心作用。

4.3 對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

OTA可以對(duì)多個(gè)代謝通路的蛋白(包括酶)、調(diào)節(jié)因子的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)，從而影響細(xì)胞中某些信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)非遺傳毒性機(jī)制來(lái)控制關(guān)鍵基因表達(dá)，這也可能是其致毒機(jī)理的一個(gè)重要方面。

Cosimi等［39］發(fā)現(xiàn) OTA能有效地抑制中國(guó)倉(cāng)鼠AA8細(xì)胞中核酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II并能夠誘導(dǎo)多倍體產(chǎn)生，研究者認(rèn)為是由于該酶在誘導(dǎo)核內(nèi)復(fù)制細(xì)胞分裂時(shí)染色體沒(méi)有正確分離。并且該研究發(fā)現(xiàn)OTA能干擾染色體分離和有絲分裂進(jìn)行的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子如Cdk1，細(xì)胞周期蛋白B，Plk等，導(dǎo)致短暫抑制細(xì)胞有絲分裂或通過(guò)有絲分裂頻率降低等造成隨后的早熟，從而影響多倍體的形成。Cui等［40］對(duì)人的胃上皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)OTA能夠誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞停留在G2/M階段，在這些停滯的細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)OTA處理發(fā)現(xiàn)在M階段的細(xì)胞比例減小，含磷的組蛋白H3也減少，因此可以推測(cè)OTA是對(duì)G2階段產(chǎn)生影響而非M階段。OTA處理后，在蛋白水平和mRNA水平，細(xì)胞周期蛋白B1-Cdc2復(fù)合物和Cdc25C，Cdc2以及細(xì)胞周期蛋白B1均明顯降低。OTA能夠誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞凋亡，激活capase-3蛋白的分離。因此研究者認(rèn)為由Cdc25C、Cdc2以及細(xì)胞凋亡蛋白B1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和G2期的停滯可能是OTA胃毒性的早期事件。Boesch-Saadatmandi等［41］則通過(guò)對(duì)培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OTA降低了SOD超氧化物歧化酶的活性，增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的mRNA及其活性均降低。而能夠介導(dǎo) GST基因轉(zhuǎn)錄的激活蛋白-1(AP-1)和NF-E2相關(guān)因子-2(Nrf 2)的超激活也被降低，研究者認(rèn)為活性氧的增加以及GST活性的損害可能是由于AP-1和Nrf 2依賴(lài)性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這可能是OTA產(chǎn)生毒性的一個(gè)重要表現(xiàn)。

除此之外，也有研究者認(rèn)為在OTA對(duì)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的破壞所導(dǎo)致的一系列的后續(xù)信號(hào)的改變也是OTA 致毒的一個(gè)原因［42］。

4.4 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生

在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中均證明:OTA誘導(dǎo)的細(xì)胞變化能引起細(xì)胞凋亡。對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)理的研究也可能是揭示OTA致毒的一條途徑。

應(yīng)用cDNA 微陣列技術(shù) Lühe等［43］發(fā)現(xiàn) OTA 能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)腎臟細(xì)胞和體外腎近端小管細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的變化。OTA改變了在 DNA損傷(GADD153和GADD45)和細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V和凝聚素)中發(fā)揮作用的一些基因，使之在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生變化。Li等［44］則通過(guò)對(duì)非洲綠猴腎細(xì)胞和人的腎上皮細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)p53的活化能夠抑制由OTA產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡作用。進(jìn)一步研究表明p53能夠抑制JNK的活化，而JNK是通過(guò)下調(diào)Bcl-xL從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路，因此研究者認(rèn)為p53在OTA介導(dǎo)的腎上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。

4.5 與其他物質(zhì)共同作用

OTA在食物及體內(nèi)并不是單獨(dú)存在的，與其他物質(zhì)的相互影響會(huì)決定其最終的毒性。這方面的研究還比較少，還有待進(jìn)一步研究。

Ferrante等［45］在巨噬細(xì)胞系J774A.1的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，OTA能調(diào)整脂多糖誘導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，OTA濃度在30～100μmol/L時(shí)可表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴(lài)性的細(xì)胞毒性效應(yīng)，且在細(xì)胞脂多糖存在的情況下該毒性效應(yīng)增加。而單獨(dú)存在脂多糖時(shí)并不對(duì)細(xì)胞穩(wěn)定性造成影響。OTA濃度達(dá)到3μmol/L時(shí)能夠有效增加環(huán)化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達(dá)。但濃度達(dá)到10μmol/L時(shí)兩種酶的量都有所下降，并且，OTA與脂多糖共刺激時(shí)，這兩種酶及其代謝物對(duì)OTA的劑量依賴(lài)性均降低。這些結(jié)果說(shuō)明，OTA在炎癥反應(yīng)前就已經(jīng)發(fā)揮作用，且能有效應(yīng)答其他毒性物質(zhì)的刺激如脂多糖，這也模擬了環(huán)境中兩種物質(zhì)的共刺激。Rossiello等［46］通過(guò)對(duì)人體血液?jiǎn)魏思?xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)單純添加OTA并不會(huì)影響單核細(xì)胞的組織因子(tissue factor，TF)和纖溶酶原激活物抑制劑-2(plasminogen activator inhibitor 2，PAI-2)的產(chǎn)生，但是對(duì)于脂多糖誘導(dǎo)的 TF和PAI-2卻能夠產(chǎn)生劑量依賴(lài)性的抑制效果，對(duì)于由IL-1β、TNF-α等刺激產(chǎn)生的TF也可以產(chǎn)生類(lèi)似的抑制效果。研究者還通過(guò)抗原檢測(cè)和RNA分析表明OTA干擾了TF基因的轉(zhuǎn)錄。TF是凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的起始因子，PAI-2則能有效抑制纖維蛋白溶解，利于免疫炎癥反應(yīng)中纖維蛋白的積累，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。因此研究者認(rèn)為OTA引起免疫抑制的機(jī)制為:OTA對(duì)于TF的抑制能夠減弱細(xì)胞的凝血活力，纖維蛋白的產(chǎn)生以及細(xì)胞的活化，除此之外OTA對(duì)PAI-2的抑制則能增加纖維蛋白的溶解，促進(jìn)纖維蛋白的減少，這兩者均能進(jìn)而影響細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。Corcuera等［47］研究了OTA與黃曲霉毒素B1對(duì)體外HepG2的復(fù)合作用，發(fā)現(xiàn)這兩種毒素能夠制造更多的活性氧，但是OTA卻能減少黃曲霉毒素B1所導(dǎo)致的DNA損傷，如減少了黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)的DNA加合物的產(chǎn)生。

除了上述之外，研究者還對(duì)OTA誘導(dǎo)DNA加合物的產(chǎn)生等進(jìn)行了一系列的研究，但爭(zhēng)議較大［48-49］。

5 OTA生物轉(zhuǎn)化機(jī)制研究

5.1 脫毒中的生物轉(zhuǎn)化機(jī)制

由于OTA毒性強(qiáng)而且結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，因此如何去除毒素成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。就目前的研究而言，一般是通過(guò)將毒素轉(zhuǎn)移、滅活、破壞、轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的物質(zhì)從而達(dá)到脫毒的目的，主要有物理脫毒、化學(xué)脫毒和生物脫毒三類(lèi)方法。

5.1.1 物理脫毒 物理脫毒主要是通過(guò)吸附、輻照等手段達(dá)到脫毒的效果。Espejo等［50］對(duì)用于釀酒的葡萄汁進(jìn)行了活性炭的吸附實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在活性炭為0.24g/L時(shí)可以吸附葡萄汁約70%的OTA。除了活性炭之外，在體外實(shí)驗(yàn)中，目前比較有效果的有沸石、某些酵母等。但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，除了活性炭之外其他均未達(dá)到預(yù)期效果，并且有可能會(huì)導(dǎo)致必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滯留和動(dòng)物中毒［51］。通過(guò)吸附只是將毒素轉(zhuǎn)移并沒(méi)有將毒素破壞或者降解，因此還存在二次污染的問(wèn)題。γ射線輻照，能破壞毒素結(jié)構(gòu)從而脫毒，但是不易操作，需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備。

5.1.2 化學(xué)脫毒 化學(xué)脫毒主要是對(duì)毒素進(jìn)行修飾等使之變?yōu)椴痪叨拘缘奈镔|(zhì)。堿性的過(guò)氧化氫，氫氧化鈉，氨基甲烷以及氫氧化鈣銨鹽能有效減少基質(zhì)中的OTA。電化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的臭氧也能降低OTA。

5.1.3 生物脫毒 生物脫毒主要是通過(guò)生物代謝或者酶促反應(yīng)降解毒素或者修飾毒素分子而達(dá)到脫毒的目的，并且以其脫毒效果好、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)損傷、污染小、快速等特點(diǎn)已成為目前的研究熱點(diǎn)。

羧肽酶是較早發(fā)現(xiàn)的能夠降解OTA的一種酶，除此之外也有某些金屬酶被發(fā)現(xiàn)可以降解OTA如梁曉翠［52］通過(guò)篩選，從土壤中得到的 BD189菌株在24h內(nèi)能去除實(shí)驗(yàn)體系中80%以上的OTA。經(jīng)鑒定該菌株屬于莫拉氏菌科(Moraxellaceae)的不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter.sp)，通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)OTA的脫毒方式為生物降解而非細(xì)菌細(xì)胞壁的物理吸附，降解OTA的產(chǎn)物為OTα，且沒(méi)有產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的新毒性物質(zhì)，達(dá)到了脫毒目的。并且BD189菌株降解OTA的酶是胞內(nèi)金屬酶，降解OTA的時(shí)間曲線符合酶促反應(yīng)的特征，其最適反應(yīng)溫度為30℃，最適反應(yīng)pH為8.0。

除此之外，屬于乳酸菌(Lactobacillus acidophilus VM20)［53］、不動(dòng)桿菌［52］、酵母菌(Phaffia rhodozyma)［54］、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)［55］等屬的某些微生物和某些曲霉屬真菌(A.fumigatus，A.niger)［56］，在體外實(shí)驗(yàn)中降解 OTA高達(dá)95%以上，并且他們中的一部分在體外實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出降解特性且多數(shù)將OTA降解為毒性較小的OTα。微生物菌群，如牛和羊的瘤胃，小鼠的大腸和盲腸，人的腸道微生物，均可一定程度的降解OTA。

研究還發(fā)現(xiàn)，有一些物質(zhì)雖不能直接脫毒但是卻可以抵消或降低OTA產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，例如:褪黑激素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)［57］，兒茶酚類(lèi)物質(zhì)［58］，維生素 E［5］等。

5.2 加工中所應(yīng)用的脫毒手段

雖然OTA比較穩(wěn)定，但是在特定的高溫、高酸、高堿及生物酶解則會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，因此，加工工藝對(duì)產(chǎn)品中OTA含量也是有影響的。

通過(guò)清洗除塵、清除壞掉的部分可以減少一部分OTA，但是去除量小(約2%～3%)且與農(nóng)產(chǎn)品本身的狀況相關(guān)。研磨洗擦去掉糧食表皮也可以去掉表皮上積累的OTA。但是由于研磨并不是破壞或者降解毒素，可能只是將毒素重新分布或者導(dǎo)致研磨部件毒素的積累，這就引起了二次污染的問(wèn)題。

OTA具有相對(duì)的熱穩(wěn)定性，但是對(duì)于不同的溫度其穩(wěn)定性則不同。例如烘焙餅干時(shí)可以導(dǎo)致部分的OTA被破壞或者被固定，當(dāng)然其含水量低也在其中有一定的影響。通過(guò)對(duì)咖啡豆兩種不同的炙烤技術(shù)(旋轉(zhuǎn)圓柱形和流床式)分別在230℃下0、3、6、9、12、15min 和 0、0.9、1.7、2.6、3.5 和 4.3min 炙烤，對(duì)比后發(fā)現(xiàn)最長(zhǎng)炙烤時(shí)間下OTA的減少率相似，且旋轉(zhuǎn)圓柱形效果很好，88%的OTA降解。但在該實(shí)驗(yàn)中(230℃)并未發(fā)現(xiàn)OTA的完全降解，可能有水分參與的熱降解使之異構(gòu)化成其他物質(zhì)［59］。

在一些發(fā)酵食品中，酵母可以有效地降低OTA的含量，Masoud等［60］曾研究了阿拉比卡咖啡發(fā)酵中的酵母對(duì)A.ochraceus的生長(zhǎng)和OTA的含量的影響，發(fā)現(xiàn) P.anomala，P.kluyveri和 H.uvarum能抑制A.ochraceus的生長(zhǎng)，并且在麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基上，這三種酵母均能夠抑制 A.ochraceus產(chǎn)生 OTA。Cecchini等［61］還對(duì)白葡萄汁和紅葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中酵母對(duì)OTA的含量變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)酒精發(fā)酵結(jié)束后，OTA含量明顯降低，這主要為酵母降解吸收所致。

除此之外，燒烤、油炸、次氯酸鹽處理等工藝也能減少一部分OTA。

6 展望

赭曲霉毒素A毒性大、污染范圍廣、與人及動(dòng)物的健康關(guān)系密切，因此如何清除OTA及其產(chǎn)毒菌是一項(xiàng)非常艱巨的任務(wù)。農(nóng)產(chǎn)品從勞作、貯藏到加工成產(chǎn)品，整個(gè)過(guò)程的環(huán)境條件都要被嚴(yán)格控制，最大限度的降低產(chǎn)OTA菌株的污染和OTA的積累。建立快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低、自動(dòng)化程度高的OTA檢測(cè)方法也是今后研究的一大趨勢(shì)。同時(shí)還應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)OTA致毒、降解、與其他毒素及食品藥品成分互作等機(jī)理的研究，并將理論成果轉(zhuǎn)化為技術(shù)成果不斷應(yīng)用到食品安全評(píng)估上。

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Research on the mechanism of biosynthesis，biotransformation and toxicity of ochratoxin A

HAO Jun-ran1，XU Wen-tao1，2，HUANG Kun-lun1，2，*
(1.College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.The Supervision，Inspection ＆ Testing Center of Genetically Modified Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

TS201.2

A

1002-0306(2012)12-0427-07

2011-09-13 *通訊聯(lián)系人

郝俊冉(1988-)，女，碩士研究生，研究方向:食品安全。

國(guó)家社會(huì)公益性行業(yè)性科研專(zhuān)項(xiàng)(2008424083-2)。