大黃藥材蒽醌成分的HPLC指紋圖譜研究

袁 曉，高俊飛，曹 建，舒楚金，袁 萍

中國科學(xué)院武漢植物園，武漢 430074

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.唐古特大黃 Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖。為《中國藥典》2010年版第一部收載品種，是常用中藥之一。主產(chǎn)于甘肅，青海，四川等省。其性微苦，微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)。歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)。具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃之功效。大黃主要含蒽醌及其苷類、二苯乙烯類、鞣質(zhì)及多糖類成分。大黃藥材來源復(fù)雜，涉及不同種類和摻偽品，即便是同種正品也會因生長地域、采集時間、加工甚至貯存條件不同引起成分組成和含量的變化［1］.

本實(shí)驗(yàn)以不同產(chǎn)地藥用大黃為建模對象，以梯度洗脫法對大黃藥材進(jìn)行指紋圖譜研究，建立大黃的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜模型，并且充分考慮分析儀器的規(guī)范性、重現(xiàn)性及研究方法的代表性，建立不同品種大黃藥材的標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫和數(shù)據(jù)庫。更深層次將大黃指紋圖譜與藥效相結(jié)合來控制大黃質(zhì)量，為辨別藥用大黃真?zhèn)危婵刂扑幱么簏S質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)和更全面的質(zhì)量控制信息［2，3］。

1 材料及儀器、試劑

1.1 儀器

L-2000高效液相色譜儀(日立公司生產(chǎn));D-2000色譜工作站;5/25型低溫冷卻循環(huán)泵，制冷量為742～940 W，(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);JK-500B型超聲儀(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司生產(chǎn))。

1.2 試藥

乙腈為色譜純，(美國Tedia公司生產(chǎn))，其它試劑均為分析純。大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素對照藥材(中國藥品生物制品檢定所提供);大黃素-8-β-D-葡萄糖苷，大黃酸-8-β-D 葡萄糖，大黃酚-8-β-D 葡萄糖苷，大黃素甲醚-8-β-D-葡萄糖苷，白藜蘆醇，二苯乙烯苷，1，6，8-3羥基-3-羧酸蒽醌，6-羥基蘆薈大黃素由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)硅膠柱、和C18柱層析得到，經(jīng)核磁共振和紅外、質(zhì)譜儀器檢測;確定化學(xué)結(jié)構(gòu)，經(jīng)液相色譜測定其純度在98%以上。

1.3 生藥樣品來源

10個不同產(chǎn)地的大黃由2010年8月至10月從甘肅、四川、西藏.、河南、青海省收集，由中國科學(xué)院武漢植物園分類專家吳金清鑒定為掌葉大黃(Rheum palmatum L)、藥用大黃(Rheum officinale Baill)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf)。藥材來源見表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱為YMC-ODS-AQC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈(A)-0.2% 磷酸水溶液(B)。流速1.0 mL/min，檢測波長270 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 uL，梯度洗脫程序:0 min(5%A)—35 min(40%A)-60 min(90%A)。

2.2 對照品的制備

分別精密稱取干燥恒重的大黃酸，大黃酚，大黃素，大黃素甲醚，蘆薈大黃素，大黃素-8-β-D-葡萄糖苷，大黃酸-8-β-D葡萄糖，大黃酚-8-β-D葡萄糖苷，大黃素甲醚-8-β-D-葡萄糖苷，白藜蘆醇，二苯乙烯苷，1，6，8-3 羥基-3-羧酸蒽醌，6-羥基蘆薈大黃素適量，置25 mL量瓶中，甲醇超聲溶解，過0.45 um濾膜，即得［4］。

2.3 供試品溶液的制備

將藥材粉碎，過50目篩，精密稱取1.00克放入具塞錐形瓶中加30 mL甲醇，稱重，超聲30 min取出放冷，甲醇補(bǔ)失重量，提取液用0.45 μm微濾膜過濾，既得供試品溶液。

2.4 指紋圖譜的方法學(xué)研究

2.4.1 精密度試驗(yàn)

精密稱取干燥至恒重的DH1號藥材粉末1.00 g，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣5次，測得各共有相對峰面積的RSD均小于3.00%，各色譜峰的相對保留時間在平均保留時間±1 min內(nèi)，符合指紋圖譜要求，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取干燥至恒重的DH1號藥材粉末5份，每份1.00 g，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)行測定，測定各共有峰的保留時間及峰面積RSD分別小于3.00%，表明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取干燥至恒重的DH1號藥材粉末1.00 g，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測定其在 0、6、12、24、48 h 的色譜圖，結(jié)果表明，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于3.00%，表明在48小時內(nèi)供試品溶液的成分是穩(wěn)定的。符合指紋圖譜的要求［5，6］。

3 結(jié)果

3.1 13個主要色譜峰的鑒定及參比峰的選擇

供試品與對照品在同一設(shè)定好的梯度條件下進(jìn)行測試，得到相應(yīng)色譜圖，通過保留時間及紫外光譜圖比對，對指紋圖譜中相應(yīng)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)［7］。結(jié)果為4號峰位為土大黃苷;5號峰為大黃酸-8-β-D葡萄糖;10號峰為白藜蘆醇;12號峰為大黃素-8-β-D-葡萄糖苷;13號峰為6-羥基蘆薈大黃素;14號峰為大黃酚-8-β-D葡萄糖苷;15號峰為1，6，8-3羥基-3-羧酸蒽醌;16號峰為大黃素甲醚-8-β-D-葡萄糖苷;20號峰為蘆薈大黃素;21號峰為大黃酸;22號峰為大黃素;23號峰為大黃酚;24號峰為大黃素甲醚。其中23號峰大黃酚峰面積較大且較穩(wěn)定故將其作為內(nèi)參比峰(見圖2)。

3.2 指紋圖譜的建立

精密稱取不同來源的藥材粉末各1.00 g，按2.3方法配制成溶液，按2.1色譜條件進(jìn)行測定，記錄其HPLC圖。通過10批次供試品溶液測定結(jié)果所給出的峰數(shù)、積分值和保留時間等相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行分析、比較，制定優(yōu)化的大黃指紋圖譜，共獲得35個色譜峰，其中有24個共有特征峰，可作為判別大黃質(zhì)量的群體特征峰。結(jié)果見圖1。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件，制成大黃共有模式的對照指紋圖譜見圖2［8］。

3.3 不同來源的大黃相似度評價

圖1 10批次大黃的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 10 specimens of Rheum

圖2 10批不同產(chǎn)地大黃甲醇提取物的HPLC指紋圖譜共有模式(23號峰大黃酚為參比峰)Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprint of methanol extracts of 10 Rheum(chrysophanol as reference is represented by peak 23)

10種不同產(chǎn)地大黃的指紋圖譜(圖1)，利用夾角余弦原理和采用相對峰面積，以大黃酚為特征峰，求出24個共有峰面的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表2、表3。進(jìn)行相似度計算。10批大黃藥材指紋圖譜的相似度分別為 0.941，0。933，0.993，0，982，0.963，0.988，0.933，0.978，0.915，0.956.結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的10批次藥用大黃的相似度為0.915 ～0.993 之間，均大于 0.9000，說明大黃指紋圖譜具有比較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可作為大黃藥材的具有專屬性的指紋圖譜［9，10］。

表2 大黃HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間比值Table 2 Retention time of common peaks of HPLC fingerprint of Rheum

21 0.819 0.820 0.820 0.819 0.819 0.820 0.820 0.819 0.819 0.819 0.819 0.066 22 0.917 0.918 0.919 0.917 0.916 0.917 0.918 0.917 0.917 0.918 0.917 0.084 23 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000 24 1.045 1.045 1.046 1.045 1.044 1.045 1.045 1.044 1.045 1.045 1.045 0.063

表3 大黃HPLC指紋圖譜共有峰的相對峰面積Table 3 Peak area of common peaks of HPLC fingerprint of Rheum

4 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了藥用大黃的指紋圖譜對各批樣品的提取條件，結(jié)論為70%甲醇超聲提取30 min效果最好，對色譜條件進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在270 nm條件下大黃素，大黃素甲醚，蘆薈大黃素，大黃酸，大黃酚有比較好的吸收，選擇的YMC色譜柱，出峰數(shù)量多，分離度高，峰形對稱性好，選擇的洗脫梯度設(shè)置，其樣品色譜峰分離度高，有35個峰形清晰可辨，符合指紋圖譜要求。采用的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》對不同批次的大黃的HPLC指紋圖譜進(jìn)行了相似度評價，結(jié)果表明，其指紋圖譜相互間較為吻合，但由于采集時間上存在差異，各批次的大黃有效成分的含量有一定的差別，24個共有峰明顯且分離度較好，構(gòu)成了大黃的指紋圖譜，以共有模式作為大黃辨別真?zhèn)窝芯?，能提供更全面的質(zhì)量控制信息，具有參考價值。

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