弓形蟲(chóng)表面抗原P22的重組體構(gòu)建及臨床應(yīng)用研究

吳麗霞 趙玉紅 孫超 郭晶 陳詠君 張莉 楊麗榮 李新新

(1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng) 110002，2.沈陽(yáng)市婦女兒童保健中心遺傳室；遼寧沈陽(yáng) 110032，3.沈陽(yáng)市大東區(qū)婦幼保健所，遼寧沈陽(yáng) 110042，4.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034)

弓形蟲(chóng)病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(chóng)引起的一種原蟲(chóng)病，是一種人畜共患病，宿主的種類十分廣泛，人和動(dòng)物的感染率都很高。據(jù)國(guó)外報(bào)道，人群的平均感染率為25%～50%，有人推算全世界至少有5億人感染弓形蟲(chóng)。

表面抗原P22與其侵入宿主細(xì)胞有密切關(guān)系，弓形蟲(chóng)感染者血清中的IgG和IgM抗體均可識(shí)別P22表面抗原，因此P22可以作為弓形蟲(chóng)感染的診斷抗原，并具有良好的抗原性與免疫原性［1，2］。目前弓形蟲(chóng)感染診斷方法主要有免疫學(xué)檢測(cè)、直接鏡檢、病原體分離和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)等［3-5］。免疫學(xué)方法由于操作簡(jiǎn)便快捷適于臨床使用。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增P22基因片段，測(cè)序后連接到載體pGEX-4T-1進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行表達(dá)與純化，為進(jìn)一步應(yīng)用該基因進(jìn)行弓形蟲(chóng)病診斷的研究做好準(zhǔn)備。

1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)菌菌株及載體：pGEX-4T-1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，E.coli BL21購(gòu)自華美生物技術(shù)有限公司

酶及其他試劑：DNA polymerase，T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI均為 TaKaRa公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，sepharose 4B純化柱購(gòu)自華美生物技術(shù)有限公司。

ELISA試劑、酶標(biāo)板。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PCR引物 由上海英俊生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，在正向引物F1和反向引物R1分別引物BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)。

2.2 目的片段的擴(kuò)增 首先以F2為模板，F(xiàn)1和R2分別為正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為變性94℃ 30秒，退火65℃ 30秒，復(fù)性72℃ 10秒，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，再72℃延伸1分鐘。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，并回收純化PCR產(chǎn)物，命名為F1R2。以此類推，以同樣的方法擴(kuò)增回收產(chǎn)物 F3R4、F5R6、F7R8。

分別以F1和R4為正反向引物，連接F1R2和F3R4，反應(yīng)條件為變性94℃ 30秒，退火65℃ 30秒，復(fù)性72℃ 15秒，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，再72℃延伸1分鐘。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，并回收純化PCR產(chǎn)物，命名為F1R4。以同樣的方法擴(kuò)增回收產(chǎn)物F5R8。

分別以F1和R8為正反向引物，連接F1R4和F5R8，反應(yīng)條件為變性94℃ 30秒，退火65℃ 30秒，復(fù)性72℃ 30秒，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，再72℃延伸1分鐘。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，并回收純化PCR產(chǎn)物，命名為F1R8。

2.3 pGEX-4T-1-P22重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 純化的PCR產(chǎn)物F1R8經(jīng)BamHI和XhoI酶切，并與經(jīng)過(guò)同樣處理的pGEX-4T-1原核表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，抽取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切鑒定，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。

2.4 pGEX-4T-1-P22融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將含pGEX-4T-1-P22重組質(zhì)粒的BL21菌液以1∶100的比例加入到LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)后加入IPTG至終濃度為1 mmol/l，37℃誘導(dǎo)3小時(shí)后離心收集菌體，重懸于2x樣品緩沖液中，100℃煮沸，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

2.5 表達(dá)蛋白的純化 取誘導(dǎo)后的菌體培養(yǎng)液離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎后利用sepharose 4B進(jìn)行純化柱。具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2.6 重組蛋白的抗原性分析 將重組的菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，切膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，用自制的免抗弓形蟲(chóng)多抗與膜上的蛋白進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，用酶標(biāo)二抗進(jìn)行進(jìn)行檢測(cè)，TMB顯色，至目的條帶顯色清晰時(shí)終止反應(yīng)。

2.7 捕獲ELISA方法的建立 以方陣滴定法分別確定P22抗原的最佳使用濃度。用羊抗人IgMμ鏈包被酶標(biāo)板，封閉，加入待檢血清和HRP-P22并置于37℃反應(yīng)，PBS-T洗板，加顯色液37℃顯色，最后用 2 mmol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，測(cè)定吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 PCR擴(kuò)增P22片段 用設(shè)計(jì)的12條引物擴(kuò)增出了438 bp大小的DNA片段，與預(yù)期分子量大小相符(見(jiàn)圖1)。

圖1 P22基因片段擴(kuò)增結(jié)果

3.2 重組體的構(gòu)建與鑒定 將以BamHI和XhoI雙酶切的438bp產(chǎn)物與pGEX-4T-1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10中，進(jìn)行重組克隆的篩選，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，分別在438bp和5kb處出現(xiàn)條帶(見(jiàn)圖2)。

圖2 pGEX-4T-1-P22重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XhoI內(nèi)切酶酶切鑒定結(jié)果M1：DNA Marker；1：pGEX-4T-1-P22雙酶切產(chǎn)物；2：pGEX-4T-1雙酶切產(chǎn)物

3.3 重組蛋白的表達(dá)鑒定及純化 將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-P22的菌液進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDSPAGE電泳檢測(cè)，在分子量43KD處出現(xiàn)一條新的蛋白帶，其大小與推測(cè)的pGEX-4T-1-P22融合蛋白分子量一致。(見(jiàn)圖3)。

圖3 pGEX-4T-1-P22表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

3.5 Western blot鑒定 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移到NC膜上，進(jìn)行 Western blot分析(圖4)。結(jié)果在相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性抗原-抗體反應(yīng)條帶，表明表達(dá)蛋白與其抗體有良好的反應(yīng)原性。

3.6 捕獲ELISA方法的建立

3.6.1 最佳工作條件的確定 經(jīng)過(guò)試驗(yàn)最后確定P22抗原濃度為1.0 μg/ml。用羊抗人IgMμ鏈包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜；次日用封閉液封閉，室溫放置3小時(shí)；每孔加入20 μL待檢血清和100 μL HRP-P22(高碘酸鈉還原法制備)，37℃反應(yīng)60分鐘；PBS-T洗板5次，每孔加底物A、底物B各50 μL，37℃顯色15分鐘，每孔加50 μL 2 mmol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，測(cè)定吸光度值。

圖4 純化產(chǎn)物的Western blot分析

3.6.2 與意大利SORIN試劑盒的比較 應(yīng)用捕獲法檢測(cè)弓形蟲(chóng)IgM抗體與意大利SORIN試劑盒對(duì)450份臨床血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如表1所示：

表1 與意大利SORIN的弓形蟲(chóng)病毒抗體IgM檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)進(jìn)行對(duì)比

根據(jù)結(jié)果得出本院試劑盒陽(yáng)性符合率為92.16%，陰性符合率為88.06%，總的符合率為88.89%。

4 討論

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)是貓科動(dòng)物的腸道球蟲(chóng)，該蟲(chóng)呈世界性分布，人和許多動(dòng)物都能感染。引起人畜共患的弓形蟲(chóng)病大多為隱性感染，但在宿主免疫功能低下時(shí)，可造成嚴(yán)重后果。孕婦感染弓形蟲(chóng)后，可通過(guò)胎盤垂直傳播給胎兒，造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎或死胎，尤以早孕期感染后畸胎發(fā)生率高，是造成我國(guó)新生兒出生缺陷的一個(gè)重要原因。國(guó)家人口計(jì)生委已連續(xù)3年開(kāi)展了出生缺陷一級(jí)防御工作，為提高我國(guó)人口素質(zhì)，降低我國(guó)新生兒畸形兒的發(fā)病率，對(duì)孕婦進(jìn)行弓形蟲(chóng)產(chǎn)前篩查尤為必要。

目前，弓形蟲(chóng)感染診斷方法主要有病原學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等，其中免疫學(xué)方法由于操作簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。用于弓形蟲(chóng)診斷的抗原有弓形蟲(chóng)膜表面抗原、重組棒狀體蛋白、弓形蟲(chóng)微線體蛋白等。根據(jù)使用抗原的不同，檢測(cè)結(jié)果的意義也不同。

弓形蟲(chóng)速殖子表面抗原SAG2(P22)蛋白是剛地弓形蟲(chóng)主要表面抗原之一，Grimwood等［6］的研究表明，SAG2蛋白不僅在介導(dǎo)弓形蟲(chóng)速殖子的入侵過(guò)程中起很重要的作用，而且還可以增強(qiáng)免疫動(dòng)物抵抗感染的能力，具有免疫保護(hù)的作用，所以SAG2抗原很早就受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。

SAG2可以作為免疫診斷及基因工程疫苗的候選抗原，由于純化天然SAG2蛋白制備工藝復(fù)雜且得量較少，利用基因工程的方法是大量制備高純度的SAG2抗原的可行之路。

Tomavo等［7］研究發(fā)現(xiàn)，SAG2的N端前導(dǎo)信號(hào)肽與C端錨錠表膜的氨基酸序列具有高度疏水性。國(guó)外有采用PET系列表達(dá)載體的，重組蛋白的表達(dá)量為16%［8］，為了使SAG2蛋白在大腸桿菌中以可溶性形式高效表達(dá)，本研究去除序列中N端的疏水性信號(hào)肽及C端的疏水性氨基酸。選擇從N-末端第27位到第172位的1467個(gè)氨基酸，根據(jù)堿基序列并優(yōu)化稀少密碼子共合成12條引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增所需的基因片段，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-P22經(jīng)充分誘導(dǎo)后，以融合蛋白的形式在E.coli內(nèi)表達(dá)，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件使融合蛋白在上清中高效表達(dá)［9］，且P22融合蛋白具有GST標(biāo)簽便于純化，為后續(xù)工作提供了便利條件。免疫印跡試驗(yàn)顯示該重組蛋白能夠被感染弓形蟲(chóng)的兔血清識(shí)別，表明其與天然蛋白的免疫原性一致。

本研究通過(guò)基因重組的方法制備P22抗原，能夠避免由于蛋白質(zhì)抗原純度低或特異性差造成假陽(yáng)性而降低檢測(cè)特異性等問(wèn)題，為弓形蟲(chóng)感染的檢測(cè)提供更為特異、準(zhǔn)確的原料。IgM抗體是體液免疫中最早出現(xiàn)的抗體，通過(guò)該抗原建立的試劑盒可以用于孕婦的急性弓形蟲(chóng)感染檢測(cè)，對(duì)于產(chǎn)前篩查有著非常重要的意義。

［1]雷明軍，吳少庭，戴五星，等.弓形蟲(chóng)RH株膜表面抗原SAG2全長(zhǎng)基因的高效表達(dá)與抗原性分析［J］.中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2004，8(4)：231-234.

［2]Lunden A，Parmle Y SF， Bengtsson KL， et al.Use of areeombinant antigen， SAG2， expressed as a glutathione-S-transferasefusion protein to immunize mice against Toxoplasma gondii［J］.Parasitol Res，1997，83：6-9.

［3]Li S，Galvan G，Araujo FG，et al.Serodiagnosis of recently acquired Toxoplasma gondii infection using an enzyme-linked immunosorbent assay with a combination of recombinant antigens［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2000，7(5)：781-787.

［4]Burg JL，Perelman D，Kasper LH，et al.Molecular analysis of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii［J］.J Immunol，1988，141(10)：3584-3591.

［5]楊永剛，曹利民，朱蔭昌.弓形蟲(chóng)病免疫診斷用重組抗原及檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］.國(guó)際醫(yī)學(xué)寄生蟲(chóng)病雜志，2010，37(4)，248-253.

［6]Grimwood J，Smith JE.Toxoplasma gondii：the role of parasite surface and secreted proteins in host cell invasion［J］.Int J Parasitol，1996，26(2)：169-173.

［7]Toma O S，Maxtinage A，Dubremetz JF.Phosphorylation of Toxoplasma gondii major surface antigens［J］.Parasitol Res，1992，78(7)：541-544.

［8]Prince JB，Auer KL，Huskinson J，et al.Clonig，expression，and cDNA sequence of surface antigen P22 from Toxoplasma gondii［J］.MolBiochaim Parasito，1990，43(1)：97-106.

［9]聶福旭，蔣蔚，王權(quán)，等.弓形蟲(chóng)膜表面抗原SAG2蛋白的高效表達(dá)及免疫活性分析［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010，4：174-178.