真空滲透離心法提取燕麥抗凍蛋白工藝的研究

金 濤，張 英，任 瑋，張艷杰，張 暉，錢海峰，齊希光，王 立，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122;2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027)

抗凍蛋白(Antifreeze Proteins，AFPs)又叫熱滯蛋白(Thermal Hysteresis Prioteins，THPs)，最顯著的特性是其具有熱滯活性(Thermal Hysteresis Activity，THA)［1］，能夠降低水溶液的冰點(diǎn)，但對(duì)熔點(diǎn)的影響較小，從而導(dǎo)致水溶液的熔點(diǎn)和冰點(diǎn)之間出現(xiàn)一定的差值。另外，AFPs還具有其他兩個(gè)重要特征:冰晶形態(tài)效應(yīng)和重結(jié)晶抑制效應(yīng)［2］。有關(guān)抗凍蛋白的研究主要集中于動(dòng)物抗凍蛋白方面，最先從魚類中發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白［3］;對(duì)于植物抗凍蛋白的研究相對(duì)較少，而像燕麥籽粒這樣具有較硬外殼的、不易提取的研究更少。本研究對(duì)真空滲透離心法提取燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥 購(gòu)自于當(dāng)?shù)爻?六磷酸葡萄糖(G6P)、NADP·Na4、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、檸檬酸 分析純;緩沖液 Tris-HCl;PBS，Na2HPO4-檸檬酸(pH7.4;50mmol/L Na2HPO4∶25mmol/L 檸檬酸溶液(v/v)=18.17∶1.83)。

DSC-7差熱分析儀 Perkin Elmer Pyris;UV7504紫外光分光光度計(jì) 上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)外體蛋白的提取 提取方法參考Smallwood等［4］報(bào)道的方法，實(shí)驗(yàn)中略微做了改動(dòng)。低溫下保存的燕麥用去離子水沖洗3次后，用濾紙吸取表面多余的水分，將燕麥裝入燒杯，用3倍體積預(yù)冷的緩沖液(50mmol PBS，pH8.0)浸泡一定時(shí)間，再將燒杯放入真空干燥器中，抽真空至一定真空度。維持一段時(shí)間后，將氣壓緩慢恢復(fù)到正常大氣壓水平，室溫下放置5min，讓多余的提取液流出。用濾紙輕輕吸干，然后將燕麥放入合適的離心管中，離心，上清液再通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)冷凍離心機(jī)10000r/min離心15min，上清液即為燕麥質(zhì)外體蛋白提取液。

1.2.2 總蛋白的提取 參考周露等人［5］關(guān)于水稻幼苗質(zhì)外體蛋白的方法。稱取燕麥50g，用預(yù)冷的緩沖液(100mmol/L Tris-HCl，pH7.5)100mL浸泡放置冰箱中冷藏12h，冰浴將燕麥保持低溫狀態(tài)進(jìn)行初步搗碎，再加入液氮研磨，研磨時(shí)加入0.4g SiO2。收集研磨后的粉末并加入100mL的緩沖液(100mmol/L Tris-HCl pH7.5，含 0.2mol/L KCl，20mmol/L MgCl2，2mmol/L EDTA，1%TX-100，5mmol/L DTT，1mmol/L PMSF)來(lái)提取蛋白。用超聲波細(xì)胞粉碎器裂解細(xì)胞，每次超聲的時(shí)間為10s，兩次超聲的時(shí)間間隔為60s，共超聲 10次。然后將組織勻漿于 25℃，16000g，離心30min，取上清，即為蛋白提取液。

1.2.3 蛋白提取率檢測(cè) 采用Bradford方法進(jìn)行蛋白提取率測(cè)定［6］，以標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測(cè)定同等條件下待測(cè)樣品在595nm處的吸光光度值，根據(jù)測(cè)得的吸光光度值，即可計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白含量。

1.2.4 G6PDH酶活檢測(cè) 六磷酸葡萄糖脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)活性檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)5min內(nèi)340nm吸收峰的變化情況來(lái)判斷［7］。按照1mL的反應(yīng)體系配制測(cè)活反應(yīng)液:將 850μL pH7.6 0.1mol/L Tris-HCl，50μL 10mmol/L MgCl2，50μL 60mmol/L G-6-P，50μL 20mmol/L NADP·Na4充分混勻后，向上述反應(yīng)液中加入50μL的質(zhì)外體蛋白或者總蛋白提取液，迅速混勻，立即監(jiān)測(cè)340nm處吸光光度值(A340)的變化，通過(guò)上升斜率計(jì)算反應(yīng)速度，以此計(jì)算酶活效率，并設(shè)置不含蛋白提取液的對(duì)照來(lái)進(jìn)行校正。樣品污染率計(jì)算見式(1)，酶活力單位的計(jì)算見式(2)。

式中，Vt:反應(yīng)液總體積，本實(shí)驗(yàn)為0.85mL;ΔA/Δt:每分鐘吸光度變化值，實(shí)際根據(jù)初速度法取酶促反應(yīng)第一分鐘的ΔA，先后測(cè)3個(gè)平行樣取平均值;e:摩爾吸光系數(shù)，NADH在340nm處的毫摩爾消光系數(shù)為6.22;L:比色杯光徑(cm)，本實(shí)驗(yàn)中采用光徑0.5cm的比色杯;Vs:樣品體積，本實(shí)驗(yàn)為0.05mL。因此可得式(3)。

1.2.5 DSC法測(cè)定樣品THA THA反映了樣品冰點(diǎn)和熔點(diǎn)之間的差別，要準(zhǔn)確的測(cè)定THA，首先要解決的問(wèn)題就是避免溶液發(fā)生過(guò)冷現(xiàn)象，采用DSC法對(duì)樣品進(jìn)行退火處理，可以有效避免過(guò)冷狀態(tài)發(fā)生。將10μg樣品密封于鋁制坩堝中，放置在樣品池中央，當(dāng)設(shè)備穩(wěn)定后，首先降溫至-30℃，然后升溫至25℃，再降溫至-30℃，記錄體系結(jié)晶熱(ΔHm)和樣品熔點(diǎn)(Tm)。接著，緩慢升溫至樣品體系為固液混合物的狀態(tài)，稱為保留溫度(Th)，停留2min，再將溫度從Th降低至-30℃，重復(fù)上述過(guò)程，在不同的Th下停留2min，分別記錄不同Th下樣品體系開始結(jié)晶的溫度(To)，以及結(jié)晶熱(ΔHf)。以純水作為對(duì)照。冰晶含量(Φ)和THA分別為式(4)、(5)。

式中，Φ為樣品中的冰晶含量;ΔHf為保留溫度停留后繼續(xù)降溫過(guò)程中體系的放熱焓;ΔHm為樣品結(jié)晶的總放熱焓［8］。

式中，THA為樣品的熱滯活性，Th為保留溫度，To為不同保留溫度下體系的開始結(jié)晶溫度。

1.2.6 水分、灰分、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 分別參照GB5009.3-2010、GB5009.4-2010、GB5009.5-2010。

1.2.7 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在燕麥質(zhì)外體蛋白的提取過(guò)程中，緩沖液的種類、浸泡的時(shí)間、真空度、真空時(shí)間對(duì)燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白提取都有很大的影響。因此，本文蛋白提取率以及蛋白的污染程度為指標(biāo)，考察了緩沖液種類、浸泡時(shí)間、真空時(shí)間、真空度、離心時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速等6個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率以及樣品污染率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 燕麥的基本成分

經(jīng)測(cè)定，燕麥的水分含量、灰分含量和蛋白質(zhì)含量分別為10.07%、1.56%和10.58%。

2.2 緩沖液種類對(duì)蛋白質(zhì)提取率以及樣品污染率的影響

Tris-HCl、PBS和Na2HPO4-檸檬酸是幾種常用的緩沖液，因此采用此三種緩沖液為基礎(chǔ)緩沖液，并采用上述方法測(cè)定其蛋白濃度，計(jì)算提取效率結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，使用 Tris-HCl、PBS、水、Na2HPO4-檸檬酸作為緩沖液，蛋白質(zhì)提取率分別為0.034、0.058、0.019、0.050mg/g?？梢姴捎?PBS 緩沖液浸泡的燕麥蛋白提取率較其他三種更高，其蛋白提取率比Tris-HCl、水和Na2HPO4-檸檬酸分別提高了70.6%、205.2%和16%。

圖1 不同緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of buffer on the extraction efficiency of proteins

由圖2可以看出，通過(guò)計(jì)算質(zhì)外體蛋白的酶活活性與總蛋白酶活活性的比值，計(jì)算得到樣品的污染率［5］。Tris-HCl、PBS 和 Na2HPO4-檸檬酸的蛋白提取液污染率分別為2.7%、1.3%和2.7%。經(jīng)t檢驗(yàn)分析3種蛋白提取液的污染率之間沒(méi)有顯著差異。而據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，污染率低于3%即可視為無(wú)明顯污染［9］。而這3種提取液的污染率均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此標(biāo)準(zhǔn)，采用PBS為緩沖液得到的提取液的污染率略低與另兩種，提取到的質(zhì)外體蛋白純度較高，所以選PBS為緩沖液。

圖2 不同緩沖液種類對(duì)質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.2 Effect of buffer on the contamination ratio in the apoplast protein

2.3 浸泡時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率以及樣品的污染率的影響

由于燕麥籽粒有殼層包裹，直接抽真空無(wú)法提取到較多的質(zhì)外體蛋白，故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)先使燕麥在緩沖溶液中浸泡一定時(shí)間，使緩沖溶液充分的滲透，進(jìn)而再抽真空。選取15、30、45、60、75、90min 6 個(gè)時(shí)間段研究提取到質(zhì)外體蛋白的最佳浸泡時(shí)間。

由圖3可以看出浸泡時(shí)間為60min，蛋白提取效率達(dá)到最高。在15～60min浸泡時(shí)間內(nèi)，蛋白提取率提高較為明顯;60～90min浸泡時(shí)間內(nèi)，蛋白質(zhì)得率幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明在浸泡時(shí)間在60min左右時(shí)，緩沖液已完全滲透。

圖3 緩沖液浸泡時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of soaking time on the extraction efficiency of proteins

由圖4得，在浸泡時(shí)間為 45、60、75、90min時(shí)蛋白質(zhì)污染率均為1.3%，表明不同浸泡時(shí)間對(duì)質(zhì)外體蛋白質(zhì)的提取幾乎沒(méi)有污染，所以綜合蛋白質(zhì)提取率和污染率選取浸泡時(shí)間為60min較合適。

圖4 浸泡時(shí)間對(duì)質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.4 Effect of soaking time on the contamination ratio in the apoplast protein

2.4 真空時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率以及樣品的污染率的影響

真空處理時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)蛋白質(zhì)的提取效率會(huì)產(chǎn)生一定的影響，真空時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則容易造成細(xì)胞膜破裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白污染;反之則會(huì)使蛋白產(chǎn)率顯著降低，蛋白種類減少。根據(jù)以往文獻(xiàn)［10］報(bào)道，一般提取質(zhì)外體蛋白時(shí)采用的真空度都是30～40kPa，處理時(shí)間是30min。由于燕麥籽粒的外殼不易滲透，實(shí)驗(yàn)中適當(dāng)延長(zhǎng)真空處理的時(shí)間，與通常方式的30min相比，60min的蛋白質(zhì)提取率比30min的蛋白質(zhì)提取率提高了17.1%。圖5結(jié)果顯示真空處理時(shí)間在60min時(shí)蛋白質(zhì)提取率到達(dá)最高點(diǎn)，說(shuō)明延長(zhǎng)真空時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)的提取率有一定的提高。

圖5 真空時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of vacuum time on the extraction efficiency of proteins

真空時(shí)間所影響的主要方面在于對(duì)于質(zhì)外體蛋白的污染情況，時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)使細(xì)胞發(fā)生破裂，由圖6得，真空時(shí)間在45min和60min下吸光光度幾乎沒(méi)有變化，污染率均為1.3%，而真空時(shí)間在75min和90min下的污染率分別是2.7%和4.0%，表明真空時(shí)間太長(zhǎng)，蛋白質(zhì)污染率會(huì)提高，且當(dāng)真空時(shí)間90min時(shí)，已經(jīng)超過(guò)了3%，說(shuō)明有明顯污染，因此選擇真空時(shí)間為60min。

圖6 真空時(shí)間對(duì)質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.6 Effect of vacuum time on the contamination ratio in the apoplast protein

2.5 真空度對(duì)蛋白質(zhì)提取率以及樣品的污染率的影響

由圖7可知，真空度對(duì)蛋白質(zhì)的提取率影響比較明顯，真空度為0.20MPa下，蛋白質(zhì)的提取率較低，為0.018mg/g;隨著真空度的升高，提取率顯著提高，但通過(guò)與傳統(tǒng)的0.30MPa的真空度相比，0.35MPa的真空度提取率提高了25%。在真空度上升到0.35MPa時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率到達(dá)最大，之后再增加真空度則不會(huì)再有明顯提升，因此，在真空度選擇為0.35MPa時(shí)蛋白質(zhì)的提取率較高。

圖7 真空度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.7 Effect of vacuum degree on the extraction efficiency of proteins

由圖8可知，真空時(shí)間的提高對(duì)于蛋白質(zhì)的污染率的提高較真空度對(duì)于蛋白質(zhì)污染率的影響更大一些，綜合對(duì)蛋白質(zhì)的提取率和蛋白質(zhì)的污染率的影響比較，真空度選擇0.35MPa。

圖8 真空度對(duì)質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.8 Effect of vacuum degree on the contamination ratio in the apoplast protein

2.6 離心轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白質(zhì)提取率以及樣品的污染率的影響

由圖9可知，在離心轉(zhuǎn)速為3500r/min的情況下，蛋白質(zhì)的提取率最高，比離心轉(zhuǎn)速為2000r/min時(shí)的蛋白質(zhì)提取率高220%，而繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速，提取率沒(méi)有增加。

圖9 離心轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.9 Effect of the centrifugal speed on the extraction efficiency of proteins

由圖10可知，當(dāng)離心轉(zhuǎn)速在3500r/min時(shí)，蛋白質(zhì)的污染率有所提高，可能隨著離心力的增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白隨之離心出來(lái)，質(zhì)外體蛋白受到污染。總結(jié)蛋白質(zhì)的提取率和蛋白質(zhì)的污染情況，3500r/min下的提取率較3000r/min稍高，但污染率較高，所以實(shí)驗(yàn)選擇3000r/min。

圖10 離心轉(zhuǎn)速對(duì)質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.10 Effect of centrifugal speed on the contamination ratio in the apoplast protein

2.7 離心時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率以及樣品的污染率的影響

由圖11可知，當(dāng)離心時(shí)間在25min左右時(shí)，質(zhì)外體蛋白已基本離心出來(lái)，再延長(zhǎng)離心的時(shí)間對(duì)于蛋白質(zhì)的提取率沒(méi)有明顯影響。離心時(shí)間在25min時(shí)蛋白質(zhì)的提取率比離心時(shí)間為10min的蛋白質(zhì)提取率高115%。

圖11 離心時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.11 Effect of centrifugal time on the extraction efficiency of proteins

由圖12可知，不同的離心時(shí)間下，所得的吸光度值幾乎沒(méi)有變化，污染率均為3.1%，基本無(wú)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白污染，綜合考慮提取率和污染率，選擇離心25min。

圖12 離心時(shí)間對(duì)質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.12 Effect of centrifugal time on the contamination ratio in the apoplast protein

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

綜上所述，燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白的最佳提取工藝為:燕麥籽粒經(jīng)去離子水多次沖洗凈之后，在50mmol、pH8.0中PBS緩沖液浸泡60min后，0.35MPa下抽真空60min，然后在3000r/min下離心25min，再經(jīng)高速低溫10000r/min離心15min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到燕麥質(zhì)外體蛋白提取率為0.085mg/g，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)污染率為1.3%。

2.9 燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白熱滯活性的測(cè)定

從表1中可以看出，將停留溫度Th從-4.53℃逐漸升高至-3.88℃，冰晶含量逐漸降低，而熱滯活性逐漸升高。已有的研究結(jié)果認(rèn)為冰晶含量與Th是密切相關(guān)的，Th越接近熔化點(diǎn)，冰晶含量越低;反之亦然。表中也顯示冰晶含量隨著停留溫度的增高而降低，熱滯活性隨著停留溫度的增高而增大，這與已有的研究［11］相符。從圖13中也可以看出:當(dāng)樣品再次冷卻時(shí)，結(jié)晶峰并不光滑，出現(xiàn)延滯現(xiàn)象，即結(jié)晶起始溫度與保持溫度存在差異，這表明燕麥質(zhì)外體蛋白具有熱滯活性，能夠降低冰點(diǎn)。

圖13 燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白的熱滯活性Fig.13 THA of oat apoplast antifreeze protein

表1 質(zhì)外體蛋白的停留溫度、凍結(jié)起始溫度、熔點(diǎn)、冰晶核含量和熱滯活性Table 1 The hold and onset temperatures(Th and To)，the exothermic enthalpy under different hold temperature and the totle system(ΔHf and ΔHm)，the amount of ice nuclei，and the thermal hysteresis activity(THA)of the apoplast antifreeze protein

3 結(jié)論

本研究得到燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白的最佳提取工藝為:燕麥籽粒經(jīng)去離子水多次沖洗凈之后，在三倍體積 50mmol、pH8.0PBS緩沖液浸泡 60min后，0.35MPa下抽真空60min，然后在3000r/min下離心25min，再經(jīng)高速低溫10000r/min離心15min，再經(jīng)冷凍，干燥。燕麥質(zhì)外體蛋白提取率為0.085mg/g，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)污染率為1.3%。經(jīng)優(yōu)化工藝提得燕麥質(zhì)外體蛋白質(zhì)經(jīng)DSC檢測(cè)，證明所得蛋白具有明顯的熱滯活性，THA為2.07℃。

［1］田云，盧向陽(yáng)，張海文，等 .抗凍蛋白研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物工程雜志，2002(6):94-98.

［2］馮從經(jīng)，陸劍鋒，呂文靜，等 .抗凍蛋白研究進(jìn)展［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23(5):481-486.

［3］De Vries A L，Wohlschlag D E.Freezing resistance in some Antarctic fishes［J］.Science，1969，163:1073-1075.

［4］Smallwood M，Worrall D，Byass L，et al.Isolation and characterization of a novel antifreeze protein from carrot(Daucus carota)［J］.Biochem J，1999，340(2):385-391.

［5］周露，劉進(jìn)元.不同提取液提取水稻幼苗質(zhì)外體蛋白效果的比較［J］.中國(guó)生物工程雜志，2011，31(1):51-55.

［6］Yao Y，Yang Y W，Liu J Y.An efficient protein preparation for proteomic analysis of developing cotton fibers by 2-DE［J］.Electrophoresis，2006，27(22):4559-4569.

［7］Weimar M，Rothe G M.Preparation of extracts from mature spruce needles for enzymatic analyses［J］.Physiol Plant，1987，69(4):692-698.

［8］張超.冬小麥麩皮抗凍蛋白結(jié)構(gòu)及其抗凍機(jī)理的研究［D］.無(wú)錫:江南大學(xué)，2008.

［9］Alves M，F(xiàn)rancisco R，Martins I，et al.Analysis of Lupinus albus leaf apoplastic proteins in response to boron deficiency［J］.Plant Soil，2006，279:1-11.

［10］Haslam R P，Downie A L，Raveton M，et al.The assessment of enriched apoplastic extracts using proteomic approaches［J］.Ann Appl Biol，2003，143(1):81-91.

［11］陳廷超，張極震.差示掃描量熱法直接測(cè)定沙冬青抗凍蛋白的熱滯效應(yīng)［J］.生物物理學(xué)報(bào)，1996，12(1):39-42.