豆豉中鮮味組分的分離與鑒定

彭睆睆，崔 春，趙謀明

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州501641)

豆豉與腐乳、醬油、豆醬并稱為我國四大傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，距今已經(jīng)有2000多年的歷史，以其獨(dú)特而鮮美的滋味受到消費(fèi)者的歡迎［1］。長期以來，對(duì)于豆豉的研究主要集中在微生物、酶系、工藝和揮發(fā)性物質(zhì)等方面，關(guān)于豆豉中呈鮮味組份的研究仍未見系統(tǒng)的報(bào)道。大豆發(fā)酵食品，如豆醬、醬油等能產(chǎn)生比谷氨酸鈉(MSG)更溫和的鮮味，經(jīng)研究證實(shí)其來源于原料中蛋白質(zhì)經(jīng)米曲霉分泌的蛋白酶、肽酶及谷氨酰胺酶等的作用后生成的氨基酸和肽類［2］。因此，本文利用滋味稀釋分析法和感官評(píng)價(jià)對(duì)豆豉的超濾分離組份進(jìn)行研究，旨在為豆豉滋味的進(jìn)一步改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉成品 購于廣州、湖南、貴州等地，詳細(xì)見表1。實(shí)驗(yàn)中所采用試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 豆豉樣品名稱及產(chǎn)地、原料等基本信息Table 1 The name、place and other basic information of lobster sauce samples

GL－21M高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;752N紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;KDN－2C型定氮儀、KDN－40消化爐 上海纖檢儀器有限公司;Waters高效液相色譜儀 美國Waters公司;835－50氨基酸自動(dòng)分析儀日本島津公司;0.2μm濾膜 Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的前處理 樣品真空冷凍干燥后，研磨成粉末用于分析，樣品粉末置于干燥皿中保存。稱取約5.000g左右的凍干樣品粉末，加入50mL去離子水后，在室溫下振蕩提取2h后，3000r/min下離心20min，取上清液重新4000r/min離心20min，上清液為樣品豆豉水提取液，樣液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基本指標(biāo)測(cè)定 氯化鈉按GB/T 12457規(guī)定的方法測(cè)定;總氮按GB/T 5009.5規(guī)定的方法測(cè)定;氨基酸態(tài)氮按GB/T 5009.39規(guī)定的方法測(cè)定;總酸的測(cè)定均按照GB/T 5009.51規(guī)定的方法測(cè)定;還原糖測(cè)定按照ZB X 66040－1987規(guī)定檢測(cè)。

1.2.3 水溶性氮的測(cè)定方法 取2g凍干后的豆豉樣品，研磨后加去離子水連續(xù)抽提3次，離心取上清液并合并，用凱氏定氮法測(cè)定清液含氮量。

1.2.4 感官分析 感官分析評(píng)價(jià)員根據(jù)國標(biāo)GB/T 14195－1993標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選和培訓(xùn)，其中女生4名，男生3名(年齡22～30歲)。以谷氨酸鈉溶液(鮮味，0.6g/L)、蔗糖溶液(甜味，35g/L)、乳酸(酸味，1.65g/L)、L－異亮氨酸(苦味，5g/L)為標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行感官評(píng)定。將凍干的樣品分別配成6%左右的統(tǒng)一水溶性氮含量和鹽含量的濃度，在室溫(23±2)℃感官評(píng)價(jià)室進(jìn)行。感官評(píng)定訓(xùn)練及測(cè)定過程采用定量描述分析(QDA)方法［3］，并選擇使用線性圖形標(biāo)度，采用 0～9分制(無感覺－閾值感覺－微弱－中等－強(qiáng)烈)。最后采用t實(shí)驗(yàn)參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析處理數(shù)據(jù)，以消除評(píng)價(jià)員使用標(biāo)度不同部分產(chǎn)生的影響。

表2 四種豆豉的理化指標(biāo)(%)Table 2 The physical and chemical indicators of four lobster sauces(%)

1.2.5 游離氨基酸含量分析 取10mg冷凍干燥的豆豉樣品，加入4mL超純水和1mL 10%的磺基水楊酸，混勻后放置冰箱中冷藏60min后于10000r/min下離心15min，獲得上清液。將上清液調(diào)至pH2.2后經(jīng)0.2μm濾膜過濾。取濾液20μL上835－50氨基酸自動(dòng)分析儀分析。

1.2.6 豆豉水提物中肽分子量分布的研究 樣品的制備:取凍干后的凍干樣溶于水，放入離心機(jī)中離心，然后再取其上清液過0.22μm過膜進(jìn)行測(cè)定。分析條件:紫外檢測(cè)波長:280nm;洗脫液:pH7.0的磷酸鹽緩沖液;流速:1mL/min;溫度:室溫;加樣量:20μL。

1.2.7 豆豉水提物中呈鮮組分的分離 豆豉水提物分別用截留量為10、3、1ku超濾膜超濾，共分離＞10ku，3～10ku，1～3ku 和 ＜1ku 四種超濾液組分。冷凍干燥后進(jìn)行感官評(píng)定。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 本文的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0軟件和Excel 2003軟件完成，在檢驗(yàn)水平為0.05的條件下進(jìn)行顯著性差異分析。豆豉的感官屬性差異采用基于成對(duì)數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)法進(jìn)行，常規(guī)指標(biāo)數(shù)據(jù)采用方差分析法。

2 結(jié)果與討論

2.1 感官評(píng)定結(jié)果分析

感官評(píng)定結(jié)果分析如圖1所示。在四類豆豉滋味分布中，苦味、鮮味為其主導(dǎo)滋味，甜、酸味及辣味為其輔助滋味。方差分析結(jié)果顯示，四種豆豉的鮮味有顯著性差異(p＜0.05)，其中鮮味比較突出的是陽江豆豉和貴州水豆豉;天馬山和一品香的苦味顯著(p＜0.05)強(qiáng)于陽江和貴州水豆豉。四種豆豉的酸、甜味沒有顯著差異(p＞0.05)。豆豉辣味之間有顯著性差異(p＜0.05)，貴州水豆豉的辣味明顯強(qiáng)于其他豆豉，這可能是之后添加的辣椒所致;感官評(píng)定結(jié)果中天馬山和一品香的苦味突出，陽江和貴州水豆豉的鮮味突出。

2.2 常規(guī)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果分析

圖1 四種豆豉的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.1 The sensory evaluation of four lobster sauces

由表2可知，四種豆豉的各項(xiàng)指標(biāo)都達(dá)到了豆豉國家標(biāo)準(zhǔn)中的要求，其中陽江和貴州水豆豉的水溶性氮含量沒有顯著性差異(p＞0.05)，而四種豆豉之間的總蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮、總酸、氯化鈉和還原糖在存在顯著性差異(p＜0.05)，其中蛋白質(zhì)含量最高的品種是一品香，最低的品種是貴州水豆豉;氨基酸態(tài)氮含量最高的品種是水豆豉，最低的品種是一品香;總酸含量最高的品種是天馬山，最低的品種是一品香;含鹽量、還原糖和水溶性氮的含量最高的都是陽江，鹽份含量最低的品種是天馬山，還原糖最低的是水豆豉，水溶性氮含量最低的是一品香。

2.3 豆豉中游離氨基酸組成的分析

大豆發(fā)酵過程中，原料中的大分子物質(zhì)在各種酶的作用下發(fā)生一系列的生化反應(yīng)，分解成低分子化合物，這些物質(zhì)的相互結(jié)合形成了種類繁多的呈味物質(zhì)，而氨基酸是其中重要的呈味物質(zhì)。秦禮康［4］研究陳窯豆豉粑中游離氨基酸分布時(shí)發(fā)現(xiàn)豆豉粑中最豐富的是苦味氨基酸，并且苦味、甜味和鮮味氨基酸明顯高于它的滋味閾值。

四種豆豉的游離氨基酸組成及含量百分比如表3所示，其中水豆豉的游離氨基酸的組成與其他三種豆豉有明顯區(qū)別，這可能是因?yàn)槠涔劝彼岷扛?，其他氨基酸相?duì)其含量較低，導(dǎo)致很多游離氨基酸檢測(cè)不出。圖中呈苦味游離氨基酸的含量在其呈味氨基酸中所占的比例最大，天馬山、一品香和陽江豆豉的呈苦味的游離氨基酸的百分比分別達(dá)到了44.28%、39.98%和40.72%，其次含量比較高的是呈甜味和呈鮮味的游離氨基酸，所占百分比分別為36.39%、23.07%、24.30% 和 9.55%、25.02%、22.53%。雖然苦味游離氨基酸的含量高，但可能由于其它成分如苦味肽、鹽和還原糖等綜合作用導(dǎo)致三者的苦味有區(qū)別。

將每種樣品配成圖1進(jìn)行感官評(píng)價(jià)的6%左右濃度的水溶液時(shí)，天馬山、一品香和陽江豆豉的各種游離氨基酸含量均沒有達(dá)到其刺激閾值(谷氨酸)，例如陽江的呈鮮味的谷氨酸是15.96mg/g，配成6%的濃度其值為0.96mg/mL，遠(yuǎn)小于刺激閾值5mg/mL;然而貴州水豆豉的谷氨酸含量測(cè)得為215.46mg/g，配成6%濃度其值為 12.93mg/mL，遠(yuǎn)高出了其刺激閾值5mg/mL［5］，明顯高于其他種類豆豉中谷氨酸含量，這表明貴州水豆豉中高含量的谷氨酸可能是其后生產(chǎn)過程中添加的，非自然發(fā)酵而成。結(jié)合感官評(píng)價(jià)結(jié)果可見，除貴州水豆鼓外，游離氨基酸并非豆豉中呈鮮味的主要成分。

表3 四種豆豉的游離氨基酸組成(mg/g)Table 3 The free amino acid composition of four lobster sauces(mg/g)

2.4 四種豆豉中肽分子質(zhì)量分布情況的分析

食品中的肽對(duì)其味的重要性早為人類認(rèn)識(shí)，現(xiàn)目前的呈味肽分為甜味肽、苦味肽、酸味肽、咸味肽和鮮味肽，美味肽(BMP)最初是由 Yamasaki［6］從牛肉的木瓜蛋白酶消化液中分離出的辛肽，經(jīng)鑒定其一級(jí)結(jié)構(gòu)為 Lys－Gly－Asp－Glu－Ser－Leu－Leu－Ala。因其具有增強(qiáng)牛肉風(fēng)味的功能，故被稱為牛肉味肽、美味提升肽或強(qiáng)化肽［7］。國外報(bào)道了化學(xué)合成法合成的BMP的一些性質(zhì)如有很強(qiáng)的鮮味，與食鹽、MSG、IMP 和 GMP 有較好的協(xié)同作用［6，8］。鮮味肽不影響其它味覺(酸、甜、苦、咸)，且增強(qiáng)其各自的風(fēng)味特征［9］，因此它們?cè)诟鞣N蔬菜、肉、禽、乳類、水產(chǎn)類乃至酒類增味方面都有良好的效果。

四種豆豉中可溶性肽的分子量分布如表4所示。由表4可見，四種豆豉中分子量大于10ku的肽在所有豆豉中的比值都比較小，表明大豆經(jīng)過發(fā)酵過程中的大部分大分子量肽被降解成了小分子肽;其次含量比較低的是分子量在10～5ku和分子量小于1ku的肽段，含量比較高的是分布在5～3ku和3～1ku之間的肽段，并且5～1ku的肽段在四種豆豉中的含量都超過其總含量的一半。Dunkel［10］等報(bào)道分子量在1～5ku的美拉德肽能夠提升風(fēng)味，增強(qiáng)鮮味。宋美［11］等也研究得出大豆蛋白酶解液呈鮮組分主要分布在3ku以下。鄧勇［12］等研究發(fā)現(xiàn)分子量為500～1000u的大豆多肽苦味較強(qiáng)?；谶@些呈味肽方面的報(bào)道，本文采用超濾法將自然發(fā)酵鮮味突出的陽江豆豉的肽段進(jìn)行分離和感官評(píng)價(jià)，以進(jìn)一步明確其不同肽段的鮮味強(qiáng)度。豆豉肽段進(jìn)行感官評(píng)價(jià)時(shí)保持其可溶性氮含量和鹽含量相同，鮮味評(píng)價(jià)結(jié)果見表5。

表4 豆豉樣品中不同相對(duì)分子質(zhì)量肽段占總肽量比值(%)Table 4 The different molecular weight peptides ratio of lobster sauce samples(%)

表5 陽江豆豉鮮味的分布Table 5 The umani distribution of Yangjiang lobster sauce

從表5可以看出，呈最強(qiáng)鮮味的是分子量1～3ku的超濾組分，其次是分子量為3～10ku的肽段。分子量1～3ku的超濾組分在0.25g/L的濃度下仍有明顯的鮮味，該濃度遠(yuǎn)低于谷氨酸的刺激閾值(5mg/mL)，并且其肽分子量分布中1～3ku所占比例是四者最少的，這表明陽江豆豉呈鮮味的成分主要分布在1～3ku的肽段中。其中陽江豆豉的1～3ku的肽段在表4中的含量百分比和其他豆豉相比最低，與其鮮味強(qiáng)弱并不成正比，這可能是不同品種豆豉的發(fā)酵菌種不同，導(dǎo)致其酶切位點(diǎn)存在差異，致使其鮮味肽段分布存在差異。

3 結(jié)論

3.1 感官評(píng)價(jià)表明市售豆豉中天馬山和一品香的苦味突出，陽江和貴州水豆豉的鮮味突出;游離氨基酸分析表明，除貴州水豆豉外，其他三種豆豉在中自然發(fā)酵產(chǎn)生的呈鮮味的游離氨基酸都達(dá)不到其刺激閾值。

3.2 研究選取天然發(fā)酵生成的鮮味較濃的陽江豆豉，經(jīng)超濾后感官分析后發(fā)現(xiàn)，豆豉水提物中呈現(xiàn)組份主要分布在1～3ku的肽段中。

［1］李華，馮鳳琴，沈立榮，等.豆豉生理功能的研究進(jìn)展［J］.科技通報(bào)，2009，25(4):498－502.

［2］Netto F M，Galeazzi M.Production and characterization of enzymatic from soy isolate［J］.Food Science and Technology，1998，31:624－631.

［3］馬永強(qiáng)，韓春然，劉靜波.食品感官檢驗(yàn)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

［4］秦禮康.陳窯豆豉粑益酵菌、風(fēng)味物及黑色物質(zhì)研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2007.

［5］曹雁平.食品調(diào)味技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002.

［6］Yamasaki Y，Maekawa K.A peptide with delicious taste［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1978，42:1761－1765.

［7］Shahidi F.Flavor of meat，meat products and seafoods［M］.Newfoundland(Canada):Springer Netherlands，1998.

［8］Wang K，Maga J，Bechtel P.Taste properties and synergisms of beefy meaty peptide［J］.Journal of Food Science，1996，61(4):837－839.

［9］Smriga M，Mizukoshi T，Iwahata D，et al.Amino acids and minerals in ancient remnants of fish sauce(garum)sampled in the“Garum Shop”of Pompeii，Italy［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2010，23(5):442－446.

［10］Dunkel A，Koster J，Hofmann T.Molecular and sensory characterization of r－glutamyl peptides［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(16):6712－6721.

［11］宋美，郭順堂.大豆蛋白呈鮮組分的制備及其性質(zhì)研究［J］.大豆科學(xué)，2006，25(4):349－354.

［12］鄧勇，馮學(xué)武.大豆多肽分子質(zhì)量分布與苦味的確定［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，6(4):98－102.