多重PCR法檢測與分析魚塘生態(tài)系統(tǒng)大腸桿菌的耐藥基因與整合子

梁思思，李珺嶠，石 磊，吳希陽，*

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510600;2.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東廣州510600)

大腸埃希氏菌(E.coli)俗稱大腸桿菌，是埃希氏菌屬(Escherichia)的代表菌，是環(huán)境中常見的菌［1］。在一定的條件下，某些血清型的大腸桿菌會引起人或者動物患上各種病，如引起禽類的腹膜炎、氣囊炎等疾病。隨著抗生素和抗菌藥物的大量開發(fā)，人們不恰當(dāng)?shù)厥褂每咕幬?，使得大腸桿菌對抗生素的耐藥日趨嚴(yán)重。我國是世界上濫用抗生素最嚴(yán)重的國家，不合理使用抗生素的現(xiàn)象普遍存在，使得大腸桿菌耐藥性在巨大用藥壓力下逐漸增強(qiáng)［2－5］，從耐藥低水平到耐藥高水平，從單重耐藥到交叉多重耐藥的發(fā)展，這引起醫(yī)學(xué)界和社會的極大關(guān)注。細(xì)菌間基因的水平轉(zhuǎn)移是細(xì)菌多重耐藥性形成和廣泛傳播的重要原因。整合子介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥機(jī)制，因能解釋耐藥基因的高效快速傳播而備受研究者關(guān)注。研究表明，細(xì)菌通過整合子系統(tǒng)，在整合酶作用下，不斷從周圍環(huán)境捕獲外來耐藥基因，從而使細(xì)菌具有耐藥性。整合子作為可移動基因元件，可捕獲和整合細(xì)菌的耐藥基因，在細(xì)菌耐藥性的傳播和擴(kuò)散中起到了至關(guān)重要的作用［6－8］。通常以整合酶的存在與否判斷細(xì)菌內(nèi)是否存在整合子。目前根據(jù)整合子中整合酶基因(intI)的不同，將已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的整合子分為六類，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子最常見［9］。在養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中，抗生素作為飼料添加劑來預(yù)防疾病和促進(jìn)動物生長，這樣低劑量長期的使用，導(dǎo)致動物養(yǎng)殖環(huán)境中致病性大腸桿菌耐藥菌株大量產(chǎn)生，這些耐藥菌通過多種途徑進(jìn)行傳播，或?qū)⑵淠退幓蛲ㄟ^畜禽產(chǎn)品直接傳遞給人類致病菌，引起交叉耐藥，對人類的健康造成了嚴(yán)重威脅［10－11］。目前對臨床分離的大腸桿菌的耐藥基因和整合子攜帶情況分析和研究的報(bào)道很多，但國內(nèi)外對來自整個(gè)魚塘生態(tài)系統(tǒng)的大腸桿菌耐藥基因和整合子的研究還比較鮮見。本文對165株來自魚塘生態(tài)系統(tǒng)的大腸桿菌攜帶耐藥基因和整合酶基因的情況進(jìn)行了檢測，通過檢測整合酶基因的存在與否判斷大腸桿菌是否攜帶有整合子基因，并且分析魚塘生態(tài)系統(tǒng)中耐藥基因和整合子的流行狀況。

表1 整合酶引物Table 1 Primers of integrase

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株來源 165株菌，來自佛山南海某魚塘生態(tài)系統(tǒng)，包括鴨的腸道、鴨周邊生活環(huán)境的水體、土壤，魚的腸道、魚生活環(huán)境的水體、土壤。菌株接種，經(jīng)過生化鑒定，再用大腸埃希菌鑒定引物uspA進(jìn)行PCR檢測，最后確定為大腸桿菌;Mutiplex PCR Assay Kit、100bp marker 寶生物工程(大連)有限公司。

TC－25/H型基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司;6321ZJ604721型Mastercycler pro梯度PCR儀艾本德(中國)有限公司;凝膠成像儀 SERIALN;電泳儀 JNUYI。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模板制備 參考文獻(xiàn)［12］，用煮沸法制備PCR模板DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)所需要檢測的19種耐藥基因序列分別設(shè)計(jì)具有相同或者相近退火溫度的引物，分為三組。19種抗生素耐藥基因?yàn)?sulI(磺胺)、SHV(β－內(nèi)酰胺類)、CAT1(氯霉素)、dhfrV(甲氧芐啶)、FloR(氟甲砜霉素)、aadA(氨基糖苷類)、OXA(β－內(nèi)酰胺類)、TEM(β－內(nèi)酰胺類)、cmlA(氯霉素)、CITM(氨芐青霉素)、ereA(大環(huán)內(nèi)酯類)、dhfrI(甲氧芐啶)、aac(3)－I(慶大霉素)、aphA－1(氨基苷類)、MOXM、DHAM、EBCM、aac(3)－IV(阿普拉霉素)、FOXM。整合酶引物的設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［5，13－14］。如表1 所示。

反應(yīng)總體系如表2所示。整合酶檢測反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃ 退火0.5min，72℃2min，30個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 延伸 7min。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 大腸桿菌耐藥基因多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 耐藥率分析結(jié)果 對165株來自魚塘生態(tài)系統(tǒng)的大腸桿菌進(jìn)行19種耐藥基因分析，PCR結(jié)果顯示，帶有一種以上的耐藥基因的菌株有151株，陽性率為91.51%。165株大腸桿菌普遍攜帶氯霉素、β－內(nèi)酰胺類TEM、氨基苷類aphA－1耐藥基因。其中氯霉素類cmlA的陽性率最高，在165株中有105株菌攜帶氯霉素類 cmlA耐藥基因，陽性率為63.64%，其次是β－內(nèi)酰胺類TEM，有82株菌檢出攜帶β－內(nèi)酰胺類TEM耐藥基因，陽性率為49.70%。氨基糖苷類中以鏈霉素耐藥基因陽性率最高，35.15%(58/165);頭孢類藥物耐藥基因的攜帶情況表現(xiàn)為對氨芐青霉素的耐藥基因攜帶率高，MOXM和CITM的陽性率分別為29.46%(33/112)，3.03%(5/165)。詳細(xì)結(jié)果如表3所示。

對不同來源的大腸桿菌進(jìn)行分類別比較，其中TEM(β－內(nèi)酰胺類)、cmlA(氯霉素)和 aadA(氨基糖苷類鏈霉素)在鴨腸、鴨水、鴨土、魚腸、魚水、魚土中都有檢出。TEM的檢出率分別為59.34%、25.00%、40.74%、40.00%、58.33%、20.00%;氯霉素 cmlA 的檢出率比較高，分別為 63.74%、100.00%、25.93%、90.00%、83.33%、20.00%;aadA(鏈霉素)的檢出率分別為 43.96%、10.00%、37.04%、50.00%、8.33%、20.00%。在鴨腸中，(氨基苷類)aphA－1攜帶率高達(dá)96.00%;在鴨水中，cmlA(氯霉素)攜帶率高達(dá)100%;在魚腸和魚水中dhfrl(甲氧芐啶)攜帶率均為100%。詳細(xì)結(jié)果如表4所示。

2.1.2 多重耐藥水平分析 對大腸桿菌進(jìn)行多重PCR檢測結(jié)果顯示，本研究選用的大腸桿菌最多帶7種耐藥基因 (FloR、aadA、TEM、cmlA、aphA－1、MOXM、aac(3)－IV)，帶四種以上耐藥基因的菌株占46.05%，帶2、3、4、5 種耐藥基因的菌株分別有 31、35、47、18株，分別占總菌株數(shù) 18.79%、21.21%、28.48%、10.91%。在攜帶多重耐藥基因的菌株中，集中在攜帶2～5種耐藥基因。

表3 大腸桿菌19種耐藥基因檢測結(jié)果Table 3 Detection of 19 resistant genes of E.coli

表4 不同來源大腸桿菌耐藥基因檢出率(%)Table 4 Frequencies of resistant genes of E.coli from different sources(%)

2.2 大腸桿菌整合酶多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

選擇帶有四種耐藥基因以上的菌株(74株)的DNA作為模板，用多重PCR法擴(kuò)增三類整合酶基因，快速篩選出陽性菌株，結(jié)果擴(kuò)增出大小約為565、403bp左右的片段，與陽性對照確認(rèn)為Ⅰ型整合酶基因和Ⅱ型整合酶基因。74株菌株中，檢出Ⅰ整合酶基因陽性菌株的有65株，檢出率為87.84%;Ⅱ型整合酶基因陽性菌株有8株，檢出率10.81%;1株為陰性。檢測中沒發(fā)現(xiàn)有攜帶Ⅲ型整合酶基因菌株。結(jié)果如圖1、表5所示。

不同來源的攜帶多種耐藥基因的大腸桿菌幾乎全部都攜帶有Ⅰ型整合酶基因，攜帶型Ⅱ整合酶基因的菌株全部來源于鴨腸。如表6所示。

表5 整合酶檢測結(jié)果Table 5 Test result of integrase genes

3 討論

3.1 細(xì)菌耐藥狀況越來越嚴(yán)峻，而且耐藥率、多重耐藥還有逐年上升的趨勢。大腸桿菌很容易產(chǎn)生耐藥性，從而使抗菌藥物藥效降低甚至消失。讓人擔(dān)憂的是，大腸桿菌的耐藥性呈進(jìn)行性增長，這對于由于大腸桿菌感染引起的疾病的治療帶來潛在的危機(jī)。因此以對大腸桿菌的耐藥性調(diào)查以及對大腸桿菌耐藥機(jī)制進(jìn)行研究具有重要的意義，從而為解決細(xì)菌耐藥問題提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［15］。目前，大多數(shù)的研究者都集中于臨床分離的大腸桿菌的耐藥性研究，對整個(gè)魚塘生態(tài)系統(tǒng)大腸桿菌耐藥基因和整合子攜帶情況的研究還鮮有報(bào)道。隨著抗生素在養(yǎng)殖業(yè)上的廣泛使用和環(huán)境中耐藥菌的增多，我們有必要對來源于養(yǎng)殖業(yè)的大腸桿菌耐藥基因的攜帶情況進(jìn)行檢測和研究細(xì)菌耐藥傳播。

表6 不同來源大腸桿菌整合酶基因攜帶率Table 6 Frequencies of integrase genes of E.coli from different sources

圖1 整合酶基因PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR result of integrase genes

3.2 本實(shí)驗(yàn)的165株大腸桿菌來自魚塘生態(tài)系統(tǒng)中的鴨腸、鴨水、鴨土、魚腸、魚水、魚土，對其進(jìn)行19種耐藥基因(Sul1、SHV、CAT1、dhfrV、FloR、aadA、OXA、TEM、cmlA、CITM、ereA、dhfrl、aac(3)－1、FOXM、MOXM、DHAM、EBCM、aac(3)－IV、aphA－1)的多重PCR檢測。PCR結(jié)果顯示，帶有一種以上的耐藥基因的菌株有151株，陽性率為91.51%。這表明大腸桿菌中普遍帶有耐藥基因，其中以氯霉素類、β－內(nèi)酰胺類的耐藥基因居多。從多重耐藥水平來看，攜帶2種及2種以上耐藥基因的大腸桿菌比率為86.06%。在攜帶多重耐藥基因的菌株中，集中在攜帶2～5種耐藥基因。這些說明大腸桿菌的耐藥水平已經(jīng)不再停留在低水平的耐藥水平了，向多重耐藥、交叉耐藥水平發(fā)展。再對帶有4種耐藥基因以上的菌株進(jìn)行整合酶基因檢測，結(jié)果98.65%的菌株攜帶有Ⅰ型整合酶基因或Ⅱ型整合酶基因，沒有檢出Ⅲ型整合酶基因。其中Ⅰ型整合子酶基因檢出率高達(dá)87.84%。可見，在整合子介導(dǎo)的耐藥機(jī)制中，以Ⅰ型整合子為主。

3.3 Ⅰ類整合子的存在與否明顯影響著大腸桿菌的耐藥性和多重耐藥率、耐藥譜，是基因水平監(jiān)測多重耐藥性的重要指標(biāo)［13－14，16－17］。魚塘生態(tài)系統(tǒng)中的鴨腸，鴨水，鴨土，魚腸，魚水，魚土中都檢測出攜帶有耐藥基因和整合子。這說明在這個(gè)魚塘生態(tài)系統(tǒng)中，攜帶耐藥基因和整合子的菌株普遍都有分布，而多重耐藥大腸桿菌株中整合子基因又普遍存在。因此整合子可能是誘發(fā)大腸桿菌多重耐藥的重要原因，并且耐藥基因通過整合子可移動的特點(diǎn)向周圍環(huán)境傳播，從而使得周圍環(huán)境的菌株產(chǎn)生多重耐藥、交叉耐藥。

4 結(jié)論

對魚塘生態(tài)系統(tǒng)及其周圍環(huán)境進(jìn)行取樣檢測后發(fā)現(xiàn)，周圍的環(huán)境中的菌株都不同程度地?cái)y帶有耐藥基因和整合子酶基因。其中攜帶多重耐藥基因的菌株中，Ⅰ類整合酶基因的占大多數(shù)。耐藥基因可能通過整合子的整合作用向周圍環(huán)境擴(kuò)散，使得周圍環(huán)境的菌株出現(xiàn)不同程度地耐藥基因增多。

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