HPLC法同時(shí)測(cè)定八號(hào)膏中大黃素和大黃酚

高 建， 趙 萍， 夏 泉， 許杜娟，2， 高昌琨

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室安徽合肥 230022;2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院安徽合肥 230032;3.安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院安徽合肥 230038)

眾所周知，燒傷可引起嚴(yán)重的皮膚損害。中藥在燒傷治療上有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［1-2］，八號(hào)膏是安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院在上世紀(jì)七十年代中西醫(yī)結(jié)合治療燒傷的研究成果之一，是治療燒傷的特色中藥制劑，具有清熱解毒、收斂生肌等功效，主要治療深Ⅱ度燒傷，大量的臨床使用證明其效果顯著。八號(hào)膏處方由大黃、地榆、五倍子等中藥組成，由于其處方組成復(fù)雜，至今仍沒有明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重制約其進(jìn)一步開發(fā)和利用，因此對(duì)其中主要成分質(zhì)量控制的研究十分迫切。

大黃具有涼血解毒、逐瘀通經(jīng)［3］的功效?，F(xiàn)代研究表明［4］大黃中的活性成分具有瀉下、抗炎、抗菌、抗病毒等作用;此外通過大量閱讀文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，大黃、冰片等中藥在燒燙傷治療中的使用頻率最高。故為建立該制劑的定量分析方法，更好地控制質(zhì)量，對(duì)該制劑進(jìn)行了定量測(cè)定方法的研究，本試驗(yàn)選取大黃中大黃素和大黃酚為指標(biāo)，運(yùn)用目前使用廣泛的HPLC法進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

Agilent 1100(美國(guó))高效液相儀;Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μL，迪馬科技公司)色譜柱;AB135-S十萬分之一電子天平 (梅特勒-托利多中國(guó)地區(qū)生產(chǎn));SB3200超聲波清洗器 (必能信超聲公司);電熱恒溫水浴鍋 (上海醫(yī)療器械五廠)。

八號(hào)膏 (安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，批號(hào):20111021，20120110，20110724，20110821，20111222，20110623，20110305，20110725);大黃素對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110756-200110)、大黃酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):11796-200615)、大黃酸對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110757-200206)、蘆薈大黃素對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110795-200806)、大黃素甲醚對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110758-200611)。甲醇 (色譜純，美國(guó)Tedia公司)，滅菌注射用水 (超純水，湖南科倫制藥有限公司);甲醇 (分析純，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司)，85%磷酸，石油醚溶液等。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 DiamonsilC18(4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬科技公司)，phenomenex保護(hù)柱，柱芯 (3 mm×4 mm);流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)，進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃。在此條件下大黃樣品中兩種對(duì)照品與其他組分均能達(dá)到基線分離，見圖1。

圖1 對(duì)照品 (A)、制劑 (B)、大黃對(duì)照藥材 (C)和陰性對(duì)照 (D)HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取大黃素對(duì)照品和大黃酚對(duì)照品適量，加入甲醇溶液定容，制成大黃素質(zhì)量濃度為0.105 g/L，大黃酚質(zhì)量濃度為0.103 g/L的對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液 取八號(hào)膏約5 g，精密稱定，加45 mL 20%硫酸，超聲20 min酸化;于3 000 r/min離心機(jī)中離心10 min，棄去酸液后，濾渣加40 mL石油醚超聲15 min濾過，濾渣加20 mL石油醚超聲15 min，濾過，合并兩次石油醚溶液，于60℃下?lián)]干溶劑，加甲醇溶解后定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液 按照八號(hào)膏的制備工藝，制備缺少大黃的陰性樣品，并按2.3項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取大黃素對(duì)照品貯備液，甲醇稀釋至5種不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液;精密稱取大黃酚對(duì)照品貯備液，甲醇稀釋至5種不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。以上系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在2.1項(xiàng)下色譜條件下，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定各組分峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo) (Y)，以進(jìn)樣量 (μL)為橫坐標(biāo) (X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程及線性范圍。大黃素:Y=2 301X-9.604 1，r=0.999 9，線性范圍:0.016 41～0.522 μg;大黃酚:Y=420 6.8X-15.55，r=0.999 9，線性范圍:0.016 10～0.515 μg。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，大黃素、大黃酚的日內(nèi)精密度RSD(n=5)分別為0.35%、0.15%。精密吸取相同對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣3 d，每天3次，記錄峰面積，大黃素、大黃酚的日間精密度RSD分別為0.27%、0.37%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在相同色譜條件下，分別在0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得大黃素峰面積RSD為2.7%(n=6)、大黃酚峰面積RSD為2.9%(n=6)，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份，在上述相同色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得供試品中大黃素峰面積RSD為2.7%(n=6)，大黃酚峰面積RSD為2.1%(n=6)。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取八號(hào)膏6份，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，在相同色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得其中大黃素和大黃酚的濃度。分別精密移取上述溶液各100 μL，精密加入混合對(duì)照品溶液100 μL，進(jìn)樣量為10 μL，分別計(jì)算大黃素和大黃酸的加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.10 供試品定量測(cè)定 取8個(gè)批次的八號(hào)膏，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，按上述色譜條件，每批次供試品溶液分別連續(xù)進(jìn)樣3次，分別計(jì)算每批次供試品溶液中大黃素、大黃酚的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)及RSD，并計(jì)算大黃素和大黃酚的相對(duì)保留值，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表2 不同批次八號(hào)膏測(cè)定結(jié)果 (n=8)

3 討論

3.1 提取方法的選擇［5-7］經(jīng)甲醇、乙醇、三氯甲烷等提取溶劑以及超聲、回流等提取方法比較，發(fā)現(xiàn)酸化后，加熱回流方法破壞了一部分蒽醌類成分;由于超聲提取在常溫下進(jìn)行，較之加熱回流方法，蒽醌類成分不容易被破壞且提取更完全，因此選擇超聲法進(jìn)行提取。

3.2 流動(dòng)相的選擇 通過閱讀參考文獻(xiàn) ［8-12］和查閱2010年版《中國(guó)藥典》［3］，以及預(yù)實(shí)驗(yàn)中使用的流動(dòng)相如:甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)、甲醇 -乙腈 -0.1%磷酸(23∶42∶35)、乙腈-0.1%磷酸 (85∶15)等，最終選擇甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)為流動(dòng)相，分離完全，峰形較好且出峰時(shí)間最短，適合對(duì)八號(hào)膏中兩種蒽醌類成分的同時(shí)測(cè)定。

3.3 實(shí)驗(yàn)意義 燒傷制劑八號(hào)膏由大黃、地榆、五倍子等中藥組成，其中大黃為主藥之一。其含有游離的蒽醌類衍生物如大黃素、大黃酚、大黃酸等，它們對(duì)多種病毒和細(xì)菌具有抑制和殺滅作用［4］。所以制劑中大黃有效成分含有量的高低是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。蒽醌類含有量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道較多，但多集中在大黃藥材中蒽醌類成分的含有量測(cè)定，提取方法和色譜條件多種多樣;而制劑則往往是單一成分的測(cè)定。經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，八號(hào)膏制劑中含有5種蒽醌類成分，其中大黃素、大黃酚的含有量均較高，其余3種成分含有量較低，故本實(shí)驗(yàn)選擇大黃素、大黃酚作為含有量測(cè)定的指標(biāo)成分，對(duì)燒傷制劑八號(hào)膏中大黃的含有量測(cè)定方法進(jìn)行研究，為八號(hào)膏及含有大黃的中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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