麝香烏龍丸對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎軟骨組織形態(tài)及MMP-3、MMP-9表達(dá)的影響

易永澤， 王志文， 袁 強(qiáng)， 張愛國， 陳守中， 王鵬飛

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis)是一種以持續(xù)滑膜炎癥、進(jìn)行性軟骨和骨質(zhì)破壞為病理特征的全身性自身免疫疾病，患者早期游走性關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和功能障礙，晚期則表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵硬和畸形，功能喪失，甚或?qū)е職埣?。其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚?，F(xiàn)在研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases)在參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎軟骨的合成與降解中起到重要作用。麝香烏龍丸在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床治療中取得滿意療效，可顯著改善關(guān)節(jié)腫脹、功能障礙和骨破壞［1］。前期動(dòng)物試驗(yàn)表明該藥能調(diào)節(jié)RANKL/OPG信號傳導(dǎo)通路而保護(hù)軟骨部分機(jī)制［2］。本課題通過建立大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎 (adjuvant arthritis)模型，探討麝香烏龍丸對其軟骨組織形態(tài)變化及基質(zhì)降解素-1(MMP-3)和明膠酶-B(MMP-9)表達(dá)的影響，為下一步的作用機(jī)制研究和麝香烏龍丸的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級雄性Wistar大鼠40只，2～3月齡，體質(zhì)量 (180±20)g，由河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2005-0001。

1.2 藥物 麝香烏龍丸:河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院研制，由人工麝香、制川烏、生地龍、生全蝎、生黑豆組成。規(guī)格:每粒(100±5)mg、每瓶300粒。批準(zhǔn)文號為冀藥制字Z20051581。麝香烏龍丸溶于生理鹽水中制成90、180 mg/mL兩種混懸液，備用。

1.3 主要儀器及試劑 完全弗式佐劑 (FCA)購自美國sigma公司，批號045K8910;MMP-3(bs-0413R)、MMP-9(bs-2099R)免疫組化試劑盒均由北京博奧森生物科技有限公司提供;PV6001試劑盒等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;石蠟組織切片機(jī)，德國徠卡儀器有限公司;BX50型光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為正常組，其余30只大鼠用于建模，第15天按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、麝香烏龍丸1 g/(kg·d)組、麝香烏龍丸2g/(kg·d)組，每組10只。

2.2 模型建立 建模開始，先將完全弗式佐劑于振蕩器混勻，對模型組和麝香烏龍丸低、高劑量組大鼠右后足跖皮膚常規(guī)消毒，皮下注射完全弗式佐劑0.1 mL/只 (10mg/mL)致炎，1～3 d后右后足出現(xiàn)原發(fā)性炎癥反應(yīng)，明顯紅腫，后腫脹持續(xù)，12～14 d出現(xiàn)繼發(fā)性反應(yīng)達(dá)峰值，致炎側(cè)、非致炎側(cè)或雙前肢的關(guān)節(jié)和足跖腫脹，或耳、尾部炎性結(jié)節(jié)，可視為建模成功。同樣方法給A組大鼠注射生理鹽水0.1 mL/只，作為正常對照。

2.3 給藥 建模第15天開始給藥。麝香烏龍丸低、高劑量組分別灌胃麝香烏龍丸1 g/(kg·d)、2 g/(kg·d)(生理鹽水混懸液)即分別按成人體質(zhì)量用藥量的10、20倍，其余各組灌入等容量生理鹽水，每日1次，連續(xù)30 d。

2.4標(biāo)本采集及處理 于末次給藥后禁食禁水6 h斷頭處死動(dòng)物，取雙側(cè)跖趾關(guān)節(jié)置于含多聚甲醛和DEPC的固定液中固定，10%EDTA溶液脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色、Masson染色及免疫組織化學(xué)觀察。

2.5 觀察指標(biāo)方法

2.5.1軟骨組織形態(tài) 關(guān)節(jié)軟骨病理評價(jià)積分:參考文獻(xiàn)［3］就關(guān)節(jié)軟骨破壞深度、范圍、破壞處纖維組織增生、炎細(xì)胞浸潤、軟骨下反應(yīng)性骨組織增生5個(gè)方面評價(jià)積分，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分級標(biāo)準(zhǔn)①軟骨損傷深度:0級，無破壞;1級，表淺;2級，深大軟骨層的1/2;3級深達(dá)全層。②軟骨缺損范圍:0級，無缺損;1級，局造性缺損;2級，缺損大于軟骨面1/3而小于2/3。3級，缺損超過軟骨面2/3;③纖維組織增生:0級，無纖維組織增生;1級，少量;2級，中等;3級，大量。④軟骨炎細(xì)胞浸潤:0級，無炎細(xì)胞浸潤;1級，稀疏散在;2級，較密集;3級，大量。⑤軟骨下反應(yīng)性骨組織增生:0級，無增生;1級，稀疏散在;2級，較密集;3級，大量。0級記1分，1級記2分，以此類推，一張片子從5個(gè)方面積分相加為該關(guān)節(jié)軟骨破壞積分。

2.5.2 Masson染色和免疫組化 軟骨膠原纖維著色綠色為陽性細(xì)胞，MMP-3、MMP-9染色陽性細(xì)胞以胞漿和 (或)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)，用Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析，將每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野 (×200)，分別計(jì)算每個(gè)視野中的膠原纖維、MMP-3、MMP-9陽性細(xì)胞平均光密度，求其平均值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 建立EXCEL數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，采用單因素方差分析，各組間比較方差齊性用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett T3法檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對軟骨組織病理變化的影響

3.1.1 光鏡觀察HE染色切片 正常組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，軟骨細(xì)胞排列整齊。模型組關(guān)節(jié)軟骨缺損，破壞處見纖維組織增生，軟骨細(xì)胞減少，炎細(xì)胞浸潤，軟骨下骨反應(yīng)性骨組織增生活躍。麝香烏龍丸低劑量組關(guān)節(jié)軟骨輕度破壞，炎細(xì)胞稀疏散在，骨組織增生稀疏散在。麝香烏龍丸高劑量組關(guān)節(jié)軟骨破壞較麝香烏龍丸低劑量組有所減輕。

3.1.2 HE染色病理積分 結(jié)果如表1所示，模型組關(guān)節(jié)軟骨病理積分與正常組和給藥組相比，差異有顯著性 (P＜0.01);麝香烏龍丸高劑量組積分低于麝香烏龍丸低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

表1 對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)的影響(±s)

表1 對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)的影響(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.01;高劑量組與低劑量組比較，△P＜0.05。

組 別 動(dòng)物/只 積分正常組 10 4.11±0.333*模型組 10 17.80±1.549麝香烏龍丸低劑量組 10 11.30±1.703*麝香烏龍丸高劑量組 10 9.10±1.524＊△

3.1.3 光鏡觀察Masoon染色切片 正常組關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維著色綠色。模型組關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維著色綠色嚴(yán)重缺失，軟骨破壞處膠原纖維斷裂、排列紊亂。給藥組關(guān)節(jié)軟骨全層保持綠色著染，但明顯著染面積比模型組大。

3.1.4 關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維平均光密度測定 結(jié)果如表2所示，模型組關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維平均光密度與正常組和給藥組相比，差異有顯著性 (P＜0.01);麝香烏龍丸高劑量組膠原纖維平均光密度與麝香烏龍丸低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

表2 關(guān)節(jié)軟骨中膠原纖維平均光密度變化 (±s)

表2 關(guān)節(jié)軟骨中膠原纖維平均光密度變化 (±s)

注:與模型組比較，*P＜0.01;高劑量組與低劑量組比較，△P ＜0.05。

組 別 動(dòng)物/只 膠原纖維平均光密度正常組 10 1.341±0.335*模型組 10 0.158±0.038麝香烏龍丸低劑量組 10 0.432±0.119*麝香烏龍丸高劑量組 10 0.622±0.138＊△

3.2對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-3、MMP-9表達(dá)的影響 正常組大鼠的軟骨組織中有MMP-3陽性細(xì)胞表達(dá)，胞漿少量染成棕黃色顆粒，而模型組MMP-3陽性細(xì)胞表達(dá)較正常組明顯增多，麝香烏龍丸高劑量組MMP-3陽性細(xì)胞表達(dá)較模型組低，麝香烏龍丸低劑量組MMP-3陽性細(xì)胞表達(dá)較模型組低。正常組軟骨組織中少量MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)，胞漿和胞核染成棕黃色，而模型組MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)較正常組明顯增多，麝香烏龍丸高劑量組MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)較模型組低，麝香烏龍丸低劑量組MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)較模型組低。結(jié)果如表3所示。模型組的MMP-3、MMP-9平均光密度分別與正常組和給藥組比較，差異均有顯著性 (P＜0.01);麝香烏龍丸高劑量組的 MMP-3、MMP-9平均光密度分別與麝香烏龍丸低劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

表3 關(guān)節(jié)軟骨中 MMP-3、MMP-9的平均光密度變化(±s)

表3 關(guān)節(jié)軟骨中 MMP-3、MMP-9的平均光密度變化(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.01;高劑量組與低劑量組比較，△P ＜0.05。

組別 動(dòng)物/只 MMP-3平均光密度 MMP-9平均光密度正常組 10 0.095±0.008* 0.091±0.010*模型組 10 0.271±0.011 0.218±0.016麝香烏龍丸低劑量組 10 0.190±0.005* 0.171±0.010*麝香烏龍丸高劑量組 10 0.180±0.009＊△ 0.157±0.006＊△

4 討論

目前有關(guān)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨、骨質(zhì)破壞的機(jī)制及其細(xì)胞基礎(chǔ)是該病研究的焦點(diǎn)。迄今已發(fā)現(xiàn)的20余種MMPs與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病相關(guān)。選擇MMP3、MMP9作為研究對象是因?yàn)樗鼈兊乃獾孜锒酁槔w維類膠原，在軟骨破壞的過程中起著重要作用［4］。

MMP-3是對基質(zhì)起廣泛作用的一種基質(zhì)金屬蛋白酶，其主要由成滑膜細(xì)胞、纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分泌，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中，在IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子的刺激下，成纖維樣滑膜細(xì)胞合成和分泌非活性酶原形式的MMP-3，通過組織蛋白酶G、纖溶酶等的作用，轉(zhuǎn)化為具有活性的MMP-3，激活滑膜細(xì)胞分泌的膠原蛋白酶原，繼而活化其他的MMPs。MMP-3活化可導(dǎo)致纖維連接蛋白、軟骨連接蛋白以及Ⅱ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ型膠原等軟骨胞外基質(zhì)主要成分的降解。MMP-3被認(rèn)為是引起細(xì)胞外基質(zhì)降解及最終導(dǎo)致軟骨、韌帶及骨破壞的最重要的蛋白酶，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎軟骨和骨的破壞中起著一個(gè)重要的作用［5］。MMP-3作為下游炎癥介質(zhì)與IL-1β、TNF-α同樣受到Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因 6-卵泡抑素相關(guān)蛋白調(diào)控體系的調(diào)節(jié)［6］。Rosenberg等［7］認(rèn)為MMP-3裂解 MMP-9的末端肽序列，破壞半胱氨酸的巰基與鋅離子的結(jié)合，在MMP-9的最終激活中發(fā)揮重要作用。MMP-9可以降解軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅱ型、Ⅳ型和Ⅴ型膠原、蛋白多糖、彈性蛋白和明膠重要組成成分。動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)敲除MMP-9基因的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠僅表現(xiàn)出輕微的關(guān)節(jié)炎癥狀，提示MMP-9在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的關(guān)鍵作用［8］。臨床上監(jiān)測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清MMP-3和或MMP-9水平可作為評估病情活動(dòng)及骨質(zhì)破壞的指標(biāo)［9-12］，便于確定臨床治療方案。最新動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［13-17］，中醫(yī)藥具有抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型關(guān)節(jié)MMP-3或MMP-9高表達(dá)，減輕關(guān)節(jié)癥狀等優(yōu)勢。關(guān)節(jié)軟骨表面為透明軟骨，透明軟骨中纖維主要由Ⅱ型膠原蛋白組成的膠原原纖維，膠原原纖維是軟骨基質(zhì)成分之一，膠原蛋白與蛋白多糖共同賦予關(guān)節(jié)軟骨彈性和變形能力。如果遭到破壞，將其基質(zhì)成分游離出軟骨，導(dǎo)致軟骨破壞。綜上所述，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨、骨質(zhì)破壞與 MMP-3、MMP-9表達(dá)有關(guān)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”、“歷節(jié)”范疇?！端貑枴け哉摗吩?“風(fēng)寒濕三氣雜至合而為痹……，以冬遇此者為骨痹”。《素問·長刺節(jié)論》曰:“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹”。張仲景首先提出“歷節(jié)”之病名，認(rèn)為肝腎不足，寒濕侵襲為其主要病機(jī)。《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈癥并治》云:“寸口脈沉而弱，沉即主骨，沉即為腎，弱即為肝。汗出入水中，如水傷心，歷節(jié)黃汗出，故曰歷節(jié)”?！度驑O一病證方論》曰:“夫歷節(jié)疼痛，不可屈伸，身體尪羸，其腫如脫，其痛如掣，流注骨節(jié)，短氣自汗，頭眩，溫溫欲吐者，皆以風(fēng)寒相搏而成，……久而不治，令人骨節(jié)蹉跌”。臨床上類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)X攝片屬于Ⅱ期 (中期)則已有軟骨下骨質(zhì)破壞。該病主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，本虛為肝腎、氣血虧虛，表實(shí)為風(fēng)寒濕邪、痰瘀互結(jié)。治法為扶正培本、祛風(fēng)除濕、活血散寒。麝香烏龍丸源自南宋·許叔微《普濟(jì)本事方》中提出:“麝香圓，治白虎歷節(jié)，諸風(fēng)疼痛，游走無定，狀如蟲嚙，晝靜夜劇，及一切手足不測疼痛”。麝香烏龍丸由人工麝香、制川烏、生地龍、生全蝎、生黑豆五味中藥組成，本方藥簡而力專，清流潔源，標(biāo)本兼顧，使外邪得除，瘀散痰消，諸癥自愈。

本實(shí)驗(yàn)中，麝香烏龍丸低、高劑量組與模型組比較中，軟骨HE染色病理積分和軟骨Masson染色中膠原纖維平均光密度值顯著下降，提示麝香烏龍丸能改善大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨病理形態(tài)，麝香烏龍丸高劑量組優(yōu)于麝香烏龍丸低劑量組治療。麝香烏龍丸低、高劑量組均能顯著降低模型組關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-9平均光密度值，且麝香烏龍丸高劑量組優(yōu)于麝香烏龍丸低劑量組治療，表明麝香烏龍高、低劑量組丸對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎在MMP-3、MMP-9表達(dá)的影響存在量效關(guān)系，為臨床上麝香烏龍丸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎軟骨破壞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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