重樓中幾個甾體皂苷類成分對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響

畢 葳， 沈 葹， 王鵬龍， 李 強， 雷海民*

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102;2.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700;3.北京大學醫(yī)學部，北京 100083)

雞胚絨毛尿囊膜 (chick embryo chorioallantoic membrane)形成于胚胎生成早期，此時機體的免疫系統(tǒng)尚未完全建立，對各種異物幾乎不發(fā)生排斥反應，將含藥載體置于其表面，可觀察藥物對血管生成的影響，該模型對抗血管生成藥物敏感，目前仍是較理想的藥物篩選模型［1-5］。在前期的實驗中，應用雞胚絨毛尿囊膜模型對云南白藥等中成藥的抑制新生血管生成活性部位進行了篩選［6-7］，發(fā)現(xiàn)云南白藥的乙酸乙酯部位、乙醇部位具有抑制新生血管生成的活性。重樓又稱七葉一支花，為中成藥云南白藥中的主要藥物之一，以蚤休之名首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［8-9］，2010年版《中國藥典》收載的為云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis(Franch..)Hara的干燥根莖。味苦，性微寒，有小毒，歸肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效［10］。近年研究發(fā)現(xiàn)，重樓的水、甲醇、乙醇提取物、總皂苷及一些皂苷單體對多種癌細胞株都有明顯抑制作用［11-12］。另外，錢曉萍等［13］研究指出，重樓醇提物還以血管生成作為靶點，作用于內(nèi)皮細胞，抑制內(nèi)皮細胞的增殖、遷移，促使其凋亡及體外小管形成，在體內(nèi)抑制血管生成，適于抗腫瘤血管生成及相關(guān)疾病治療，該結(jié)論與課題組思路不謀而合，但文獻未能指出抑制內(nèi)皮細胞增殖的活性成分。因此，本實驗對重樓的主要成分進行了分析測定，并篩選了重樓皂苷Ⅰ等4個甾體皂苷成分的抑制血管生長活性，這不僅對其作用機理是個有利的補充，而且對抗腫瘤藥物的開發(fā)也具有重要的意義。

1 儀器與試藥

UV—Vis 8500型紫外可見分光光度計 (上海天美科學儀器公司);Bruker500型核磁共振儀;KQ—500DE型數(shù)控超聲波清洗器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。恒溫孵化箱 (北京方通孵化器廠)，超凈工作臺 (上海凈化設(shè)備廠)，解剖顯微鏡 (日本Olympus公司320040型)，電子天平 (上海精密科學儀器有限公司JY2002型)，數(shù)碼相機 (佳能A75型)，眼科鑷，眼科剪，表面皿，打孔器。硅膠 (柱層析及薄層層析用)(青島海洋化工廠);石油醚、環(huán)己烷、乙酸乙酯、95%乙醇、甲醇、丙酮、冰醋酸 (分析純，購于北京化工廠);蒸餾水 (自制);醫(yī)用酒精、生理鹽水(購于同仁堂藥店);明膠海綿 (江蘇金陵制藥廠)。蘇拉明 (由北京市藥檢所提供);德國羅曼雞胚蛋，蛋質(zhì)量50～60 g(由中國農(nóng)業(yè)大學提供)。

2 實驗部分

2.1 成分分離 取2 kg重樓藥材，依次用10倍量的石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、水分3次超聲提取，每次30 min，過濾后，上清液減壓濃縮后得到各部位。取乙酸乙酯部位60 g用適量乙醇分散后，2倍量的硅膠拌樣，30倍量硅膠裝柱，上樣，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇、乙醇洗脫，TLC法檢測，合并相同流份。得到化合物1、2、3、4。

2.2 活性研究

2.2.1 樣品制備 精密稱取蘇拉明5 mg，用30%乙醇溶解，定容至10 mL。精密稱取各受試純品(重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅴ和纖細薯蕷皂苷)，用乙醇溶解，配制成質(zhì)量濃度約為0.4 mg/mL的溶液。將明膠海綿用打孔器制成直徑約為6 mm的圓形小塊，無菌環(huán)境下用微量進樣器向小塊內(nèi)加藥。陽性藥和樣品均加5 μL。待明膠海綿將藥物完全吸收干燥后，置于紫外燈下消毒風干，備用。

2.2.2 實驗方法 選擇體質(zhì)量相近 (50～60 g)，表皮無污染、無破損的新鮮種蛋，消毒后，置于溫度 (37.8±0.5)℃、相對濕度65% ～70%的恒溫孵化箱中孵育，每日早中晚各翻轉(zhuǎn)一次，孵育7 d后，將種蛋隨機分為6組，即空白組、蘇拉明組、重樓皂苷Ⅰ組、重樓皂苷Ⅱ組、重樓皂苷Ⅴ組和纖細薯蕷皂苷組，每組15枚。在超凈臺上將蛋胚用酒精消毒后用牙科鉆在蛋胚頂端鉆一小孔，去掉周圍的蛋殼和殼膜，使開口約為1.2 cm×1.2 cm大小;確定加樣部位后用注射針頭從氣室與卵黃分隔處挑破氣室膜，注入1～2滴無菌水，使氣室膜與雞胚絨毛尿囊膜分開，用鑷子輕輕去除上層的氣室膜，暴露下層的雞胚絨毛尿囊膜。將加藥并消毒后的明膠海綿小塊置于近胚頭1 cm處兩條前卵黃靜脈之間的相對無血管區(qū)。用透明膠紙封閉卵殼口，(37.8±0.5)℃孵育2 d。

2.2.3 觀察計數(shù)以及統(tǒng)計分析方法 給藥后的雞胚在 (37.8±0.5)℃的恒溫孵化箱中孵育2 d后，取出，撕去透明膠紙，用甲醇-丙酮 (1∶1)將加藥的雞胚尿囊膜血管固化10 min，小心剝下雞胚絨毛尿囊膜，用眼科剪將雞胚尿囊膜以明膠海綿為圓心剪成直徑約為2 cm的圓，置于載玻片上，在顯微鏡下觀察、照相。數(shù)據(jù)以血管個數(shù)均數(shù) (x)表示，以空白組作為標準組，等級資料采用Ridit分析，以P＜0.05表示數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:無色透明針晶或白色粉末，易溶于三氯甲烷、甲醇。ESI-MS(m/z):855［M+］，722 ［M-Arb］-，576 ［M-Arb-Rha］-，415［M-Arb-Rha-Glu］-，397［M-Arb-Rha-Glu-H2O］-，379［MArb-Rha-Glu-2H2O］-，283，271，253，251，213，199，173，159，147，139，129，107，93，85，69，55(100%)。1HNMR(DMSO-d6) δ:5.336(1H，br，H-6)，0.9(3H，s，H-9，-CH3)，0.739(3H，s，H-18)0.915(3H，d，J=6.7 Hz，H-21-CH3)，0.74(6H， s， H-18-CH3， H-27-CH3)，2.43，2.15(2H，m，H-1)，1.8(4H，m，H-2，4)，3.48(1H，m，H-3)，1.53(1H，m，H-8)，4.88(1H，m，H-10)，1.5(2H，m，H-11)，1.16(2H，m，H-12)，1.8(1H，s，H-13)，1.93(2H，m，H-15)，4.27(1H，m，H-16)，3.4(1H，m，H-17)，0.96(3H，s，19-CH3)，1.82(1H，m，H-20)，1.53～1.60(2H，m，H-24)，3.42、3.21(2H，m，H-26)，4.43(1H，d，J=7.8 Hz，Glu-H-1')，3.35(1H，m，Glu-H-2')，3.23(1H，m，Glu-H-3')，3.26(1H，m，Glu-H-4')，3.47(1H，m，Glu-H-5')，3.60(1H，m，Glu-H-6')，5.037(1H，s，Rha-H-1″)，3.64(1H，s，Rha-H-2″)，3.41(1H，s，Rha-H-3″)，3.19(1H，s，Rha-H-4″)，3.99(1H，s，Rha-H-5″)，1.089(3H，d，J=6.0Hz，Rha-H-6″)，4.88(1H，s，Ara-H-1?)，3.68(1H，s，Ara-H-3?)，3.86(1H，s，Ara-H-4?)，3.67(1H，s，Ara-H-5?)。13CNMR(DMSO-d6)δ:38.1(C-1)，29.5(C-2)，76.5(C-3)，37.3(C-4)，140.7(C-5)，121.7(C-6)，32.0(C-7)，30.3(C-8)，50.0(C-9)，36.9(C-10)，20.8(C-11)，39.9(C-12)，40.5(C-13)，56.2(C-14)，32.0(C-15)，80.7(C-16)，62.2(C-17)，16.5(C-18)，19.4(C-19)，41.6(C-20)，15.1(C-21)，108.9(C-22)，31.4(C-23)，28.9(C-24)，31.4(C-25)，66.4(C-26)，17.6(C-27)，98.4(Glc C-1)，76.9(Glc C-2)，76.3(Glc C-3)，75.3(Glc C-4)，76.1(Glc C-5)，61.8(Glc C-6)，100.5(Rha C-1)，70.9(Rha C-2)，71(Rha C-3)，72.3(Rha C-4)，68.4(Rha C-5)，18.2(Rha C-6)，108.2(Ara C-1)，81.8(Ara C-2)，76.8(Ara C-3)，84.9(Ara C-4)，60.4(Ara C-5)。結(jié)合文獻 ［14-15］鑒定為重樓皂苷Ⅰ。

化合物2:白色粉末，易溶于三氯甲烷、甲醇、乙醇等溶劑。ESI-MS(m/z):721(M-H+)，575 ［M-146-H］-，344，302。1HNMR(DMSO-d6)δ:0.964(3H，s，H-19)，0.910(3H，d，J=6.9 Hz，H-21)，0.740(3H，s，H-18)，0.740(3H，d，J=7.0 Hz，H-27)，5.81(1H，s，H-6)，8.08(1H，s， -OH)，10.6(1H，s， -OH)，4.35(1H，m，glu-H-1')，3.18(1H，m，glu-H-3')，4.00(1H，m，glu-H-5')，5.340(1H，m，glu-H-6')，5.126(1H，d，J=5.7 Hz，Rha-H-1″)，1.085(3H，d，J=6.0 Hz，Rha-H-6″)。13CNMR(DMSO-d6)δ:38.1(C-1)，29.5(C-2)，76.7(C-3)，37.3(C-4)，140.8(C-5)，121.7(C-6)，32.0(C-7)，30.3(C-8)，50.0(C-9)，36.9(C-10)，20.8(C-11)，39.9(C-12)，40.5(C-13)，56.2(C-14)，31.9(C-15)，80.7(C-16)，62.2(C-17)，16.5(C-18)，19.4(C-19)，41.6(C-20)，15.2(C-21)，108.9(C-22)，31.4(C-23)，28.9(C-24)，31.4(C-25)，66.4(C-26)，17.6(C-27)，98.6(Glc C-1)，76.7(Glc C-2)，77.0(Glc C-3)，70.7(Glc C-4)，78.2(Glc C-5)，61.8(Glc C-6)，100.5(Rha C-1)，70.9(Rha C-2)，71(Rha C-3)，72.3(Rha C-4)，68.4(Rha C-5)，18.2(Rha C-6)。結(jié)合文獻 ［14-15］最終鑒定該化合物結(jié)構(gòu)為薯蕷皂苷元-3-O-［α-L-吡喃鼠李糖基 (l→2)］-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即重樓皂苷Ⅴ。

化合物3:白色粉末 (甲醇)，可溶于乙醇，難溶于石油醚、乙酸乙酯等溶劑。ESI-MS負離子(m/z):883 ［M-H］-，737 ［M-H-146］-，721［M-H-162］-，575 ［M-H-146-162］-，413 ［M-H-146-162-162］-。1HNMR (DMSO-d6) δ:0.74(6H，s，18-CH3，27-CH3)，0.91(3H，d，J=6.7 Hz，21-CH3)，0.96(3H，s，19-CH3)，1.09(3H，d，J=6.0 Hz，Rha-CH3)，δ5.34(1H，br，H-6)。13CNMR(DMSO-d6)δ:38.1(C-1)，29.5(C-2)，76.4(C-3)，37.8(C-4)，140.7(C-5)，121.8(C-6)，31.9(C-7)，30.3(C-8)，50.0(C-9)，37.3(C-10)，20.8(C-11)，39.9(C-12)，40.5(C-13)，56.2(C-14)，31.9(C-15)，80.6(C-16)，62.2(C-17)，16.5(C-18)，19.4(C-19)，41.6(C-20)，15.1(C-21)，108.9(C-22)，31.4(C-23)，28.9(C-24)，31.4(C-25)，66.4(C-26)，17.6(C-27)，98.3(Glc C-1)，77.4(Glc C-2)，88.9(Glc C-3)，68.9(Glc C-4)，76.3(Glc C-5)，61.4(Glc C-6)，101.0(Rha C-1)，70.8(Rha C-2)，70.9(Rha C-3)，72.4(Rha C-4)，68.6(Rha C-5)，18.3(Rha C-6)，103.7(Glc C-1')，73.8(Glc C-2')，77.2(Glc C-3')，70.4(Glc C-4')，75.5(Glc C-5')，61.2(Glc C-6')。結(jié)合文獻［14-15］最終鑒定該化合物結(jié)構(gòu)為纖細薯蕷皂苷。

化合物4:白色粉末 (甲醇)，可溶于乙醇，難溶于石油醚、乙酸乙酯等溶劑。ESI-MS負離子m/z:1013［M-H］-，867［M-H-146］-，721 ［MH-146-146］-，575 ［M-H-146-146-146］-，413［M-H-3 ×146-162］-。1HNMR(DMSO-d6)δ:0.74(6H，s，18-CH3，27-CH3)，0.91(3H，d，J=6.7 Hz，21-CH3)，0.96(3H，s，19-CH3)，1.09(3H，d，J=6.0 Hz，Rha-CH3)，1.12(6H，d，J=5.9 Hz，2Rha-CH3)，5.33(1H，br，H-6)。13CNMR(DMSO-d6)δ:38.1(C-1)，29.5(C-2)，76.5(C-3)，37.3(C-4)，140.8(C-5)，121.7(C-6)，31.9(C-7)，30.3(C-8)，50.1(C-9)，36.9(C-10)，20.8(C-11)，39.9(C-12)，40.5(C-13)，56.2(C-14)，31.9(C-15)，80.7(C-16)，62.2(C-17)，16.5(C-18)，19.4(C-19)，41.6(C-20)，15.1(C-21)，108.9(C-22)，31.4(C-23)，28.5(C-24)，31.4(C-25)，66.4(C-26)，17.5(C-27)，98.7(Glc C-1)，77.5(Glc C-2)，77.5(Glc C-3)，76.7(Glc C-4)，75.8(Glc C-5)，61.2(Glc C-6)，100.8(Rha C-1)，70.9(Rha C-2)，71.1(Rha C-3)，72.4(Rha C-4)，68.4(Rha C-5)，18.3(Rha C-6)，100.5(Rha C-1')，71.8(Rha C-2')，71.2(Rha C-3')，78.4(Rha C-4')，67.3(Rha C-5')，18.6(Rha C-6')，101.5(Rha C-1″)，70.9(Rha C-2″)，71.1(Rha C-3″)，72.4(Rha C-4″)，69.4(Rha C-5″)，18.3(Rha C-6″)。結(jié)合文獻 ［14-15］最終鑒定該化合物結(jié)構(gòu)為重樓皂苷Ⅱ。

3.2 活性結(jié)果

3.2.1 形態(tài)學觀察 從形態(tài)學上可以看出，空白組血管生長正常，主次血脈分明，血管豐富，新生血管多，血色鮮明，載體周圍血管走形正常，均圍繞藥膜向四周輻射出去，血管分布清晰;陽性組與空白組相比，血管明顯減少，顏色灰暗，各給藥組尤其是重樓皂苷Ⅰ組載體在與雞胚絨毛尿囊膜直接接觸的下方，血管生長較少，血管分支也少，因此，推測它們可能有抑制血管生長的作用。

3.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 將血管按照直徑進行統(tǒng)計，將數(shù)據(jù)分為大、中、小三個等級。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(±s)表示。

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表1。

不同化合物對雞胚絨毛尿囊膜血管的影響見圖1。

表1 雞胚絨毛尿囊膜血管數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果Tab.1 Statistical results of vascular numbers in chick embryo chorioallantoic membrane

3.2.3 統(tǒng)計結(jié)果 以空白組作為對照組，將各組數(shù)據(jù)進行Ridit分析，重樓皂苷I組P＜0.05，其95%可信區(qū)間為0.62±(2×0.052)，即0.52～0.73，重樓皂苷I有抑制新生血管生成的作用。結(jié)果見表1，圖2。

圖1 化合物1，2，3，4對雞胚絨毛尿囊膜血管的影響Fig.1 Influence of compound 1，2，3，4 on angiogenesis in chick embryo chorioallantoic membrane

圖2 給藥后各組血管數(shù)目比較Fig.2 Statistical results of vascular numbers in chick embryo chorioallantoic membrane

4 討論

Ridit分析結(jié)果顯示，重樓皂苷I有抑制血管新生的作用。但由于大血管和中血管在給藥之前就已經(jīng)形成，因此，在分析數(shù)據(jù)時，主要對小血管進行分析比較，故認為重樓皂苷Ⅱ和纖細薯蕷皂苷亦有抑制血管新生的趨勢。從圖2中可以看出重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和纖細薯蕷皂苷的活性順序為纖細薯蕷皂苷＜重樓皂苷Ⅱ＜重樓皂苷Ⅰ。重樓皂苷Ⅰ的活性最佳，纖細薯蕷皂苷活性最弱，重樓皂苷Ⅴ沒有活性。比較它們的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ是唯一含有阿拉伯糖的成分，因此推測阿拉伯糖對抑制血管生長活性有重要貢獻;另外重樓皂苷Ⅴ不具有抑制血管生長的活性，纖細薯蕷皂苷的活性最低，它們的結(jié)構(gòu)中與苷元直接相連的葡萄糖的4位上沒有糖取代，而重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅰ的結(jié)構(gòu)中葡萄糖的4位上有糖取代，因此推測與苷元直接相連的葡萄糖的4位上的糖取代對活性也有重要意義。纖細薯蕷皂苷的活性大于重樓皂苷Ⅴ的活性，是由于纖細薯蕷皂苷的結(jié)構(gòu)中比重樓皂苷Ⅴ結(jié)構(gòu)中的糖的數(shù)目多。因此得到如下結(jié)論:若薯蕷皂苷結(jié)構(gòu)中含有阿拉伯糖，抑制血管生長活性增強;若皂苷結(jié)構(gòu)中與苷元直接相連的葡萄糖的4位上有糖取代，抑制血管活性增強;結(jié)構(gòu)中糖的數(shù)目增多，抑制血管活性增強。在下一步的研究過程中，將對它們抑制血管生長活性的量效關(guān)系進行詳細的研究。

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