益氣化瘀化痰養(yǎng)陰方劑對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1表達(dá)的影響

李 艷， 曹文富

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶401331)

肝纖維化是肝臟遭到各種致病原侵襲時(shí)，肝臟細(xì)胞外基質(zhì)分泌與降解失衡，從而在肝細(xì)胞間隙可逆性沉積的結(jié)果［1］。當(dāng)前痰濁膠結(jié)加之氣虛血瘀促成肝纖維化是目前中醫(yī)醫(yī)學(xué)家對(duì)肝纖維化核心病機(jī)的共識(shí)。多年來(lái)，中醫(yī)治療肝纖維化取得了較好的臨床效果，但是如何以更科學(xué)手段和方法來(lái)揭示中醫(yī)治療效果，同時(shí)，反過(guò)來(lái)更有益指導(dǎo)中醫(yī)臨床治療成為當(dāng)前重要科學(xué)問(wèn)題。近年諸多文獻(xiàn)有采用突出益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰等方法治療肝纖維化，以及突出幾種配伍方法結(jié)合治療肝纖維化的文獻(xiàn)報(bào)道，但是依然不能揭開(kāi)這些方法治療的有效性能，對(duì)其效價(jià)不能進(jìn)行單獨(dú)評(píng)價(jià)和衡量。益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四法單獨(dú)應(yīng)用和合用到底有什么療效上的區(qū)別依然是困惑中西醫(yī)臨床的重要問(wèn)題。許多文獻(xiàn)表明，TGF-β1是目前已知致肝纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子，在形成肝纖維化的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，以作為檢測(cè)肝纖維化的重要標(biāo)志物［2-3］。因此，在本研究中分別采用益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰單劑和合劑治療肝纖維化，通過(guò)檢測(cè)肝纖維化程度和TGF-β1作為中藥治療肝纖維化的療效指標(biāo)，以期初步揭示益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四法單劑與合劑的治療效價(jià)，有益今后判斷用藥的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 雄性SD大鼠130只，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào) syxk(渝)20070001］。兔抗 TGF-β1(abcom)，RNA提取相關(guān)試劑 (天根公司)，TRPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (東洋紡)，BCA試劑盒、蛋白裂解液 (碧云天公司)，山羊HRP標(biāo)記二抗 (北京中杉)。

1.2 藥物 (1)精選中藥黃芪、白術(shù)，按1∶1比例配伍，混合水提并濃縮成益氣飲 (每1 mL含生藥2 g)。

(2)精選中藥川芎、姜黃，按1∶1比例配伍，混合水提并濃縮成化瘀飲 (每1 mL含生藥2 g)。

(3)精選中藥半夏、海藻，按1∶1比例配伍，混合水提并濃縮成化痰飲 (每1 mL含生藥2 g)。

(4)精選中藥鱉甲、白芍，按2∶1比例配伍，混合水提并濃縮成養(yǎng)陰飲 (每1 mL含生藥2 g)。

(5)精選中藥黃芪、白術(shù)、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍、鱉甲，按1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶2比例配伍，混合水提并濃縮成益氣化瘀化痰養(yǎng)陰的合劑 (每1 mL含生藥2 g)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 130只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只、肝纖維化模型組20只、益氣組20只、化瘀組20只、化痰組20只、養(yǎng)陰組20只、合劑組20只。

1.3.2 造模方法 除正常對(duì)照組大鼠給予正常普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組大鼠:(1)給予39.5%玉米面+40%面粉+20%豬油+0.5%膽固醇組成的高脂低蛋白飼料;(2)采用背部皮下注射40%CCl4油劑，每周2次，共計(jì)12周。第一周的2次皮下注射劑量皆為0.5 mL/100 g體質(zhì)量，以后每次注射劑量為0.3 mL/100g體質(zhì)量，安排每周星期2和星期5進(jìn)行。建立肝纖維化大鼠模型，并將試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分入相應(yīng)各組;(3)每天5%酒精作為唯一飲料。造模12周后，死亡率為55%左右，即除正常對(duì)照組大鼠無(wú)死亡外，其它6組實(shí)驗(yàn)組，每組平均剩9只SD肝纖維化大鼠，只對(duì)益氣組、化瘀組、養(yǎng)陰組、化痰組、合劑組此5組用藥。中藥的用量，黃芪、白術(shù)、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍皆為6 468 g，鱉甲12 936 g。

1.3.3 給藥方法 (1)益氣組、化瘀組、化痰組、養(yǎng)陰組、合劑組，各組剩下的9只實(shí)驗(yàn)大鼠用相對(duì)應(yīng)的中藥飲劑——益氣飲、化瘀飲、化痰飲、養(yǎng)陰飲及合劑灌胃;每只大鼠按約3 mL/(100 g·d)劑量灌胃;(2)肝纖維化模型組:9只大鼠生理鹽水灌胃 (劑量約3 mL/(100 g·d);(3)正常對(duì)照組:10只大鼠生理鹽水灌胃 (劑量約3 mL/(100 g·d)。連續(xù)14周。

1.3.4 標(biāo)本留取 最后一次用藥后24 h，免疫組化標(biāo)本采用心臟灌注方法取標(biāo)本，電鏡和分子生物學(xué)標(biāo)本采用麻醉大鼠，斷頭處死大鼠取肝臟，取部分肝組織用10%中性福爾馬林溶液或戊二醛-鋨酸雙重固定，待做免疫組化或電鏡檢查，其余標(biāo)本于液氮中冷凍后再轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱中保存。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 電鏡觀察 電鏡顯示各實(shí)驗(yàn)組肝臟的超微結(jié)構(gòu)變化、膠原纖維的沉積情況等。見(jiàn)圖1.

1.4.2 Masson三色膠原染色 對(duì)肝組織石蠟切片進(jìn)行Masson法常規(guī)纖維染色，光鏡觀察肝纖維化程度等。

1.4.3 RT-PCR法檢測(cè)肝組織TGF-β1 mRNA表達(dá)提取大鼠肝組織總RNA，然后在42℃20 min條件下逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。于 genebank中查的大鼠TGF-β1和GAPDH整個(gè)核酸序列，利用Premier5.0查得其引物詳見(jiàn)下列，退火溫度56℃。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94℃ 4 min，變性94℃，30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物再濃度為1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。在紫外燈光下觀察電泳結(jié)果，并用凝膠在Bio-Rad公司所生產(chǎn)的凝膠成像儀上用Quantityone圖像分析軟件進(jìn)行照相分析。各條帶的相對(duì)光密度值=目的條帶光密度值/內(nèi)參GAPDH條帶光密度值。

GAPDH:上游:GTGGAGTCTACTGGCGTCTT;下游:GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT，擴(kuò)增275 bp

TGF-β1: 上 游:CATGGAGCTGGTGAAACG;下游:TGAAGCGAAAGCCCTGTA，擴(kuò)增548 bp

1.4.4 Western blot法檢測(cè)肝組織TGF-β1蛋白表達(dá) 肝臟組織，加入10倍體積的組織裂解液勻漿，冰浴30 min后，4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清，BCA試劑盒蛋白定量，組織總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。30 g蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，3%BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃過(guò)夜，TBS-T洗膜后加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，經(jīng)EC檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組TGF-β1蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用用方差分析和LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05確定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組大鼠益氣化瘀化痰養(yǎng)陰單劑與合劑對(duì)肝纖維化大鼠肝組織電鏡影響變化Fig.1 Effects of electron microscope on rats of hepatic fibrosis by single prescriptions and mixture of benefiting“qi”，removing blood stasis，reducing phlegm and nourishing“yin”

2 結(jié)果

2.1 電鏡結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠肝組織切片電鏡顯示，肝組織一切正常，其周圍無(wú)明顯膠原纖維沉積 (見(jiàn)圖1a)。肝纖維化模型組可見(jiàn)膽小管擴(kuò)張(見(jiàn)圖1b)，肝組織大量膠原纖維沉積 (見(jiàn)圖1c)。益氣組可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、見(jiàn)髓樣變，少量膠原纖維沉積 (見(jiàn)圖1d)。化瘀組可見(jiàn)血竇內(nèi)微絨毛輕微腫脹和變性 (見(jiàn)圖1e)，膽小管改變不明顯，極輕微擴(kuò)張，少量細(xì)胞見(jiàn)脂滴 (見(jiàn)圖1f)?；到M可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹，有部分溶解，肝細(xì)胞間隙增大，膽小管擴(kuò)張，內(nèi)見(jiàn)髓樣變 (見(jiàn)圖1g)。養(yǎng)陰組可見(jiàn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、溶解，膽小管未見(jiàn)擴(kuò)張，胞漿有很輕微的溶解 (見(jiàn)圖1h)。合劑組可見(jiàn)正常肝細(xì)胞，血竇內(nèi)微絨毛改變不明顯 (見(jiàn)圖1i)。

2.2 Masson三色膠原染色結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠肝組織切片顯示，肝組織一切正常，其周圍無(wú)明顯膠原纖維沉積 (見(jiàn)圖2a)。肝纖維化模型組可見(jiàn)肝組織內(nèi)大量膠原纖維沉積 (見(jiàn)圖2b、2c)。益氣組(見(jiàn)圖2d)、化痰組 (見(jiàn)圖2e)、化瘀組 (見(jiàn)圖2f)、養(yǎng)陰組 (見(jiàn)圖2g)皆可見(jiàn)肝內(nèi)膠原纖維組織中度增生。合劑組肝內(nèi)膠原纖維組織增生不明顯(見(jiàn)圖2h)。

圖2 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰單劑與合劑對(duì)肝纖維化大鼠肝組織的Masson三色膠原染色 (×400)Fig.2 The VG staining in the rats of hepatic fibrosis by single presctiptions and mixture of benefiting“qi”，removing blood stasis，reducing phlegm and nourishing“yin”(×400)

2.3 RT-PCR檢測(cè)TGF-β1 mRNA的表達(dá) 與肝纖維化模型組相比，益氣組、化瘀組、化痰組、養(yǎng)陰組中大鼠肝組織 TGF-β1基因表達(dá)降低 (P＜0.01)，其中養(yǎng)陰組與化瘀組、益氣組、化痰組相比，大鼠肝組織TGF-β1基因表達(dá)相對(duì)明顯降低(P＜0.05)。與益氣組、化瘀組、化痰組、養(yǎng)陰組相比，合劑組中大鼠肝組織TGF-β1基因表達(dá)明顯降低 (P＜0.05)見(jiàn)圖3，表1。

圖3 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰單劑與合劑對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1mRNA的表達(dá)影響Fig.3 Effects of TGF-β1 TGF-β1mRNA expression on rats of hepatic fibrosis by single prescriptions and mixture of benefiting“qi”，removing blood stasis，reducing phlegm and nourishing“yin”

2.4 Western Blot法檢測(cè)肝組織TGF-β1蛋白表達(dá) 與肝纖維化模型組相比，益氣組、化瘀組、化痰組、養(yǎng)陰組中大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)降低(P＜0.01)，其中養(yǎng)陰組與化瘀組、益氣組、化痰組相比，大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)相對(duì)明顯降低 (P＜0.05);與益氣組、化瘀組、化痰組、養(yǎng)陰組相比，合劑組中大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低 (P＜0.05)見(jiàn)圖4。

圖4 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰單劑與合劑對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1蛋白的表達(dá)影響Fig.4 Effects of TGF-β1 TGF-β1 protein expression on rats of hepatic fibrosis by single prescriptions and mixture of benefiting“qi”，removing blood stasis，reducing phlegm and nourishing“yin”

3 討論

肝纖維化是由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉淀的病理過(guò)程，作為一種慢性、進(jìn)行性、彌漫性的肝臟病變，治療不及時(shí)或治療不當(dāng)都可使其發(fā)展為肝硬化。許多文獻(xiàn)表明，TGF-β1是目前已知致肝纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子，在形成肝纖維化的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［2］。在血液中，TGF-β1作為一種失活的蛋白能夠被多種因素激活［4-5］。激活的TGF-β1具有內(nèi)分泌和旁分泌的作用，通過(guò)結(jié)合肝細(xì)胞表面的TGF-β1受體，來(lái)激活MAPK和Smad信號(hào)通路促使肝星狀細(xì)胞活化［6］，從而導(dǎo)致過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)的沉積［7］，最終導(dǎo)致肝纖維化。前述說(shuō)明TGF-β1在肝纖維形成過(guò)程中起著重要的作用，可以用來(lái)作為肝纖維化的重要參考指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰單劑均能夠降低肝纖維化模型組肝組織內(nèi)纖維化程度，但是它們之間卻有降低程序的差異。在單獨(dú)的四種方法治療中，養(yǎng)陰法治療效果最好，益氣法治療效果最差，化瘀法與化痰法之間差異不大，說(shuō)明化瘀與化痰在治療上均達(dá)到同等的效果。四種單獨(dú)治療方法的比較，使今后在用藥文獻(xiàn)更趨于重養(yǎng)陰之法。研究發(fā)現(xiàn)，與單劑相比，共用益氣化瘀化痰養(yǎng)陰四法更能夠有效降低肝組織內(nèi)纖維化程度，說(shuō)明單獨(dú)治療雖然不能完全達(dá)到最好的療效，但是它們?cè)诠餐湮橹袇s起到更好的治療作用。

肝纖維化屬于近代醫(yī)學(xué)提出的西醫(yī)診斷名稱，中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域根據(jù)臨床癥候特點(diǎn)，可歸屬于中醫(yī)“脅痛”、“積聚”、“痰凝”、“黃疸”等病范疇，而中醫(yī)治療突出整體觀念和辨證論治，所以治療方法也多異，無(wú)完全統(tǒng)一的治療模式和方法。其總體病機(jī)既可歸結(jié)于氣虛使津液不能正化，故凝而為痰;又可為外感六淫、內(nèi)傷七情、飲食失當(dāng)?shù)榷喾N致病因素致氣機(jī)阻滯而致病;另外正如《血證論》中所云“血不利則為水，水凝而成痰”，“血積既久，亦能化為痰水”，“久病血運(yùn)不利”，最終形成肝纖維化病機(jī)的中心環(huán)節(jié)是痰濁膠結(jié)加之氣虛血瘀促成。痰阻則氣血不利，而致血滯血瘀，加之痰濁與瘀血互為因果，互相轉(zhuǎn)化，相互膠結(jié)，臟腑氣血功能日益虛損和失調(diào)，而致頑癥重癥，病情纏綿難愈。近些年來(lái)，采用益氣活血、化瘀化痰、養(yǎng)陰軟堅(jiān)等均可以有效延緩或抑制治療肝纖維化進(jìn)程，取得了較好的療效。養(yǎng)陰藥中鱉甲味咸，性微寒，歸肝、腎經(jīng)，具有滋陰潛陽(yáng)、軟堅(jiān)散結(jié)、退熱除蒸等功效。鱉甲含骨膠原、碳酸鈣、磷酸鈣、中華鱉多糖和17種氨基酸，還含有十多種微量元素，可提高機(jī)體免疫力，其所含的大量氨基酸具有抑制肝臟纖維增生、促進(jìn)肝內(nèi)新生纖維吸收的作用，成為治療肝纖維化應(yīng)用最廣的藥物之一［8］。白芍是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有養(yǎng)血柔肝、緩中止痛、斂陰收汗之功效。白芍總苷是白芍根中提取的有效部位，具有明顯的抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等作用，能夠降低肝纖維化大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，透明質(zhì)酸以及PCⅢ膠原的水平，抑制肝星狀細(xì)胞的功能及促進(jìn)其凋亡等，從而對(duì)肝纖維化大鼠具有良好的防治作用［9］。另外有研究表明，姜黃、黃芪、川芎等藥物可以顯著抑制實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠模型的肝纖維化，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1的表達(dá)有關(guān)［10］;復(fù)方黃芪顆?？梢栽诘鞍姿皆鰪?qiáng)MMP-2酶蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制TIMP-2酶蛋白的表達(dá)，促進(jìn)ECM的降解，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的目的［11］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法單劑和合劑，通過(guò)抑制TGF-β1產(chǎn)生和表達(dá)，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)形成和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，改善肝組織器官代謝狀況等途徑，從而抑制與延緩肝纖維化的進(jìn)程，控制肝纖維化這類難治性疾病的進(jìn)展［12］。

總之，本研究提示益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四法單劑治療都可以降低肝組織內(nèi)纖維化程度，但也有程度差異;四劑合用更能夠明顯降低肝組織內(nèi)纖維化程度，說(shuō)明益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法對(duì)肝纖維化能達(dá)到更好的療效，這種治療特點(diǎn)可以有效指導(dǎo)臨床，對(duì)于深入闡釋中醫(yī)藥益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法治療肝纖維化的機(jī)制，不斷提高中醫(yī)藥防治肝纖維化的水平，促進(jìn)學(xué)科進(jìn)步具有重要意義。

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