不同處理鳳仙花對(duì)瘤胃微生物體外產(chǎn)甲烷及發(fā)酵特性的影響

張志紅 黃江麗 田曉娟 黃 黃 張國(guó)華 王東升 印遇龍 丁建南*

(1.江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌 330029;2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長(zhǎng)沙 410125)

隨著全球氣候變暖形勢(shì)的日益嚴(yán)峻，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注溫室氣體的排放問題。甲烷(CH4)作為重要的溫室氣體之一，其溫室效應(yīng)是二氧化碳(CO2)的20～30倍。畜牧業(yè)對(duì)全球溫室效應(yīng)的貢獻(xiàn)率為9% ～18%，而反芻動(dòng)物排放的CH4約占其中的80%［1］。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)生成的CH4不僅加劇了溫室效應(yīng)，同時(shí)也降低了飼料利用率，造成2% ～15%飼料總能的損失［2］。因此，研究降低瘤胃CH4排放的措施和新型添加劑已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。研究表明，抗生素、離子型載體等物質(zhì)能有效改善瘤胃發(fā)酵，降低CH4產(chǎn)量［3］。但此類物質(zhì)長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致微生物產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留，同時(shí)影響動(dòng)物產(chǎn)品的品質(zhì)，給動(dòng)物或人類健康帶來(lái)威脅。研究發(fā)現(xiàn)，一些植物提取物具有調(diào)節(jié)瘤胃微生物發(fā)酵，減少 CH4釋放的效果［4－6］。因此，大力發(fā)掘植物提取物亦成為瘤胃CH4減排研究的熱點(diǎn)［7－8］。鳳仙花(Impatiens balsamina L.)是鳳仙花科鳳仙花屬植物，為一年生草本植物，主要分布于熱帶地區(qū)及亞熱帶地區(qū)，在中國(guó)主要產(chǎn)于西南地區(qū)［9］。本課題組在篩選降CH4藥用植物時(shí)發(fā)現(xiàn)，與青蒿、蒲公英等植物比較，鳳仙花具有顯著的降CH4效果［10］。目前國(guó)內(nèi)外很少有關(guān)于鳳仙花降低瘤胃CH4生成的報(bào)道，本試驗(yàn)采用體外厭氧培養(yǎng)技術(shù)，旨在通過(guò)研究不同處理鳳仙花對(duì)瘤胃微生物CH4產(chǎn)生和發(fā)酵特性的影響，并通過(guò)對(duì) CH4、氨態(tài)氮(NH3－N)以及微生物蛋白質(zhì)(MCP)等特征指標(biāo)的分析，初步評(píng)價(jià)鳳仙花能否作為反芻動(dòng)物降CH4植物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料與人工飼料

鳳仙花為江西省科學(xué)院生物資源研究所植物遺傳育種研究室栽培，開花后期整株采收，全株風(fēng)干后粉碎過(guò)1 mm篩成為固體粉劑。固體粉劑在50℃下分別在70%乙醇和蒸餾水中浸泡48 h，料液比為1∶4，浸泡之后用超聲波提取，超聲波頻率為20 000 Hz，提取溫度為50℃。通過(guò)抽濾得到粗提液，在60℃左右將粗提液濃縮到總體積的1/5，即為鳳仙花水或乙醇浸提液。人工飼料選用稻草、玉米和黃豆，粉碎過(guò)1 mm篩備用。

1.1.2 瘤胃液

瘤胃液取自裝有永久性瘤胃瘺管的黃牛，試驗(yàn)動(dòng)物每天飼喂2次，飼喂時(shí)間為07:00和17:00，自由飲水。晨飼2 h后采集瘤胃瘺管中新鮮瘤胃液，迅速裝入充有氮?dú)獾淖苑獯?，并?9℃保溫瓶帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集的瘤胃液用4層脫脂紗布在大燒杯中過(guò)濾，過(guò)濾時(shí)在厭氧袋中操作，減少微生物與空氣接觸機(jī)會(huì)。量取所需體積的瘤胃液迅速加入到準(zhǔn)備好的人工唾液中(瘤胃液與人工唾液體積比為1∶2)，制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在開始前新鮮配制。人工唾液的配制參照Menke等［11］的方法。

1.1.3 瘤胃體外培養(yǎng)裝置

本研究使用的瘤胃體外培養(yǎng)裝置是在王全軍等［12］所用培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上改造而成，裝置由2部分組成，即培養(yǎng)瓶和50 mL全玻璃注射器(浙江寧波和平注射器廠)。培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)液和人工飼料后，瓶口用反口膠塞和鋁蓋密封。在膠塞和鋁蓋上插入注射器，注射器接觸的地方用密封帶密封，同時(shí)注射器外圍再用醫(yī)用膠布固定。注射器每次使用之前洗凈晾干，用凡士林涂沫注射器，減少注射器內(nèi)腔和塞之間摩擦。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)10個(gè)處理，即對(duì)照(無(wú)任何添加劑，CK);3個(gè)水平的鳳仙花水浸提液，添加量分別是培養(yǎng)液裝量的0.5%、1.0%和2.5%(W1、W2和W3);3個(gè)水平的鳳仙花乙醇浸提液，添加量分別是培養(yǎng)液裝量的0.5%、1.0%和2.5%(E1、E2和E3);3個(gè)水平的鳳仙花固體粉劑，添加量分別是培養(yǎng)液裝量的0.5%、1.0%和2.5%(S1、S2和S3)。每個(gè)處理設(shè)7個(gè)平行，每個(gè)培養(yǎng)瓶為1個(gè)平行，試驗(yàn)連續(xù)重復(fù)3個(gè)批次。

1.2.2 體外培養(yǎng)試驗(yàn)操作

分別稱取稻草粉、玉米粉和黃豆粉0.90、0.45和0.15 g，組成體外培養(yǎng)所用人工飼料。將人工飼料送入250 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入不同處理鳳仙花制劑。在厭氧操作袋中打開培養(yǎng)瓶，分別向每個(gè)瓶中加入人工瘤胃培養(yǎng)液200 mL，與人工飼料混合均勻。迅速蓋上膠塞和鋁蓋，用注射針頭導(dǎo)入氮?dú)?，?qū)除瓶中空氣，確保培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)為厭氧環(huán)境，插上注射器(標(biāo)注1 mL刻度)。將培養(yǎng)瓶放入(39.0±0.5)℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)24 h。12、18和24 h記錄注射器讀數(shù)，放空注射器再插回培養(yǎng)瓶。各個(gè)處理的注射器讀數(shù)與校正對(duì)照(只有培養(yǎng)液沒有飼料底物)比較后，轉(zhuǎn)換成產(chǎn)氣量。公式為:產(chǎn)氣量=Vt－Vi，其中Vt為各處理發(fā)酵t小時(shí)的注射器讀數(shù)，Vi為校正對(duì)照發(fā)酵t小時(shí)的注射器讀數(shù)。發(fā)酵至終點(diǎn)后迅速測(cè)定瓶中CH4和CO2含量，收集各處理發(fā)酵液，測(cè)定pH、NH3－N和MCP含量。

1.2.3 測(cè)定方法

CO2和 CH4含量的測(cè)定:CO2含量用 GASBOARD沼氣分析儀(武漢四方光電科技有限公司)測(cè)定;CH4含量用島津氣相色譜儀器測(cè)定:采用 HP－INNOWAX(19091N －133)毛細(xì)管柱，測(cè)定條件為柱溫80℃、氣化室溫度100℃、檢測(cè)室溫度120℃，載氣使用高純氮?dú)?。?0 μL微量注射器分別抽取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μL CH4標(biāo)準(zhǔn)氣，根據(jù)CH4含量和其峰面積關(guān)系，確定CH4標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體條件參照胡偉蓮等［13］的方法。

發(fā)酵液參數(shù)測(cè)定:發(fā)酵液pH用梅特勒－托利多酸度計(jì)直接測(cè)定;NH3－N含量測(cè)定采用水楊酸鈉－次氯酸鈉比色法，具體過(guò)程參照馮宗慈等［14］的方法;MCP含量測(cè)定參照 Makkar等［15］分步離心法進(jìn)行樣品的預(yù)處理，采用考馬斯亮藍(lán)(G250)比色法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行記錄整理，統(tǒng)計(jì)分析采用SAS V8軟件的Turkey法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 不同處理鳳仙花對(duì)體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

從表1看出，不同處理的鳳仙花體外培養(yǎng)瘤胃產(chǎn)氣量不同。比較12 h產(chǎn)氣量，CK產(chǎn)氣量最低，S3比CK產(chǎn)氣量提高了86.7%(P＜0.05)，且顯著高于其他鳳仙花處理(P＜0.05)。18 h產(chǎn)氣量中，CK也是最低，S1、S2和S3均顯著高于其他處理(P＜0.05)。24 h產(chǎn)氣量中，CK依然最低，S1、S2、S3和 E3顯著高于其他處理(P ＜0.05)。比較24 h累積產(chǎn)氣量，固體粉劑處理均顯著高于CK(P＜0.05)，平均為96.02 mL，比 CK提高了56.8%;E2和E3顯著高于 CK(P＜0.05)，乙醇浸提液處理累積產(chǎn)氣量平均為76.37 mL，比CK提高了24.7%;水浸提液僅W3累積產(chǎn)氣量顯著高于CK(P＜0.05)，3個(gè)處理平均為69.90 mL，比CK提高了14.1%。鳳仙花不同處理中，添加量和產(chǎn)氣量之間也表現(xiàn)出一定關(guān)系，添加量低，產(chǎn)氣量低，添加量高時(shí)，產(chǎn)氣量也相應(yīng)提高。

表1 不同處理鳳仙花對(duì)體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響Table 1 Effects of different preparations of Impatiens balsamina on gas production in vitro rumen fermentation

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，相同字母表示差異不顯著(P＞0.05)。下表同。

In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，while with the same letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

2.2 不同處理鳳仙花對(duì)體外瘤胃發(fā)酵CH4、CO2含量和pH的影響

不同處理鳳仙花對(duì)體外培養(yǎng)CH4、CO2含量以及pH的影響見表2，CK CH4含量最高，而S3為0，完全抑制了CH4生成;S1、S2和E3 CH4含量小于1%，W1和W2與CK比較，沒有顯著差異(P＞0.05)。比較鳳仙花不同添加量對(duì)CH4含量的影響可以發(fā)現(xiàn)，隨著添加量增加，CH4含量越來(lái)越低。CO2含量變化與CH4相反，在所有處理中，CK最低，S3最高，S3比CK提高了88.5%(P＜0.05)。鳳仙花3種添加方式中，固體粉劑對(duì)CO2含量提高最明顯，平均比CK提高了64.9%，其次是乙醇浸提液，平均比CK提高了36.1%，水浸提液效果較差，平均比CK提高了11.2%。隨著添加量的增加，CO2含量提高十分明顯。pH變化趨勢(shì)與CH4相同，CK最高，S3最低，并且差異顯著(P＜0.05)。鳳仙花不同處理中，固體粉劑降低pH最明顯。

2.3 不同處理鳳仙花對(duì)體外瘤胃發(fā)酵NH3－N含量的影響

NH3－N是瘤胃微生物發(fā)酵一個(gè)重要參數(shù)，反映了瘤胃代謝狀態(tài)。不同處理鳳仙花對(duì)NH3－N含量的影響見表3，CK最高，S3最低，差異顯著(P＜0.05)。NH3－N含量整體變化趨勢(shì)與CH4相似，添加量相同時(shí)，鳳仙花固體粉劑降低最明顯。隨著添加量的增加，NH3－N含量降低越明顯，S1、S2和S3分別比CK降低了41.1%(P＜0.05)、52.2%(P ＜0.05)和 55.4%(P ＜0.05)，E1、E2和E3分別比CK降低了12.8%(P＞0.05)、29.7%(P ＜0.05)和 48.2%(P ＜0.05)，W1、W2和W3分別比CK降低了5.9%(P＞0.05)、6.2%(P＞0.05)和42.9%(P＜0.05)。

表2 不同處理鳳仙花對(duì)體外瘤胃發(fā)酵CH4、CO2含量和pH的影響(24 h)Table 2 Effects of different preparations of Impatiens balsamina on CH4，CO2contents and pH in vitro rumen fermentation(24 h)

表3 不同處理鳳仙花對(duì)體外瘤胃發(fā)酵NH3－N和MCP含量的影響(24 h)Table 3 Effects of different preparations of Impatiens balsamina on NH3－N and MCP contents in vitro rumen fermentation(24 h)

2.4 不同處理鳳仙花對(duì)體外瘤胃發(fā)酵MCP的影響

從表3看出，體外發(fā)酵液中CK的MCP含量最低，鳳仙花固體粉劑處理的MCP含量高，S1、S2和S3分別比CK提高了84.9%(P＜0.05)、139.7%(P＜0.05)和199.7%(P＜0.05);E1、E2和E3分別比CK提高了60.0%(P＜0.05)、77.4%(P＜0.05)和94.8%(P＜0.05);水浸提液對(duì)MCP提高效果比乙醇浸提液差，W1、W2和W3分別比CK提高了4.5%(P＞0.05)、30.5%(P＞0.05)和43.1%(P＜0.05)。在鳳仙花相同處理中，隨著添加量的增加，MCP含量逐漸提高。

3 討論

3.1 不同處理鳳仙花對(duì)體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量以及CH4和CO2含量的影響

研究結(jié)果表明，產(chǎn)氣量越高，瘤胃內(nèi)的發(fā)酵活動(dòng)越劇烈，對(duì)反芻動(dòng)物的促進(jìn)作用越明顯［16］。從試驗(yàn)結(jié)果看，鳳仙花不同處理對(duì)體外瘤胃發(fā)酵有一定影響，與CK比較，從開始到培養(yǎng)結(jié)束，鳳仙花均可以刺激瘤胃微生物發(fā)酵代謝活動(dòng)，提高瘤胃產(chǎn)氣量，添加量高時(shí)效果越明顯。鳳仙花對(duì)CH4和CO2含量的影響相反，CH4含量均比CK低，這可能是與CH4生成受到抑制時(shí)，引起CO2和氫氣(H2)等的累積有關(guān)［17］，其中原因以及瘤胃中產(chǎn)CH4微生物的變化特征還有待進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，莫能菌素具有明顯降低CH4生成的效果，但是在飼糧中莫能菌素含量較高時(shí)抑制CO2產(chǎn)生，影響瘤胃微生物代謝活動(dòng)，初步分析兩者降甲烷作用方式可能不同。

3.2 不同處理鳳仙花對(duì)體外瘤胃發(fā)酵pH的影響

瘤胃液pH是反映瘤胃內(nèi)發(fā)酵狀況的一項(xiàng)綜合指標(biāo)。瘤胃微生物以瘤胃為其直接的生長(zhǎng)環(huán)境，pH過(guò)高或過(guò)低對(duì)瘤胃微生物的正常生長(zhǎng)、發(fā)育及發(fā)酵均有不利的影響。通常認(rèn)為正常的瘤胃pH變化范圍為6～7，當(dāng)pH低于6時(shí)，纖維分解菌和原蟲數(shù)量將減少，飼糧中纖維素和蛋白質(zhì)的降解率就會(huì)降低［18］。在本試驗(yàn)中體外發(fā)酵24 h各處理pH均大于6，pH的變化范圍未超出瘤胃微生物的最適生長(zhǎng)范圍。隨著不同處理鳳仙花添加量的增加，pH有降低的趨勢(shì)，但對(duì)瘤胃發(fā)酵沒有產(chǎn)生不利影響。添加鳳仙花引起pH降低，分析原因可能是鳳仙花改變了瘤胃微生物發(fā)酵方式，引起揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等物質(zhì)增加，又由于采用不連續(xù)體外培養(yǎng)方式，造成代謝產(chǎn)物不能及時(shí)排出而累積［19］。

3.3 不同處理鳳仙花對(duì)體外瘤胃發(fā)酵NH3－N和MCP含量的影響

瘤胃液中NH3－N是瘤胃氮代謝過(guò)程中外源蛋白質(zhì)和內(nèi)源含氮物質(zhì)降解的重要產(chǎn)物，同時(shí)也是瘤胃微生物合成MCP的原料，它反映了瘤胃內(nèi)微生物氮的供應(yīng)狀況［20］。MCP代謝是瘤胃微生物區(qū)系營(yíng)養(yǎng)代謝的一個(gè)重要組成部分，是反芻動(dòng)物最主要的氮源供應(yīng)者，它可以滿足動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要量的40%～80%。由于體外培養(yǎng)沒有瘤胃壁對(duì)NH3－N 的吸收、分泌等的影響，所以 NH3－N 的含量主要取決于2個(gè)方面:一方面是瘤胃微生物降解飼糧中的含氮化合物為NH3－N的能力，另一方面是瘤胃微生物利用NH3－N合成MCP的能力。本試驗(yàn)中，體外培養(yǎng)24 h后，添加鳳仙花各處理的NH3－N含量不同程度低于 CK，降低了5.8% ～55.4%;MCP含量相反，鳳仙花處理均比CK高，比CK增加了4.5%～199.7%。結(jié)果表明，鳳仙花處理刺激了瘤胃微生物代謝活動(dòng)，促進(jìn)NH3－N向MCP轉(zhuǎn)化，加快了MCP的合成，這個(gè)結(jié)果與前人報(bào)道茶皂素等植物提取物具有減少瘤胃NH3－N含量、促進(jìn)MCP合成［21］的結(jié)論一致。

3.4 鳳仙花不同處理方式瘤胃發(fā)酵效果比較

比較鳳仙花水和乙醇浸提液以及固體粉劑體外瘤胃發(fā)酵效果，從CH4、CO2和MCP含量等數(shù)據(jù)看，添加量相同時(shí)，固體粉劑的效果最好，水浸提液效果最差。直接添加固體粉劑，其中的糖、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也可被微生物利用，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，因此效果更好。鳳仙花乙醇浸提液效果比水浸提液好，這表明降CH4有效成分極性較弱，更容易被有機(jī)溶劑浸提。因此，在以后研究中可以選用不同有機(jī)溶劑浸提鳳仙花，比較體外培養(yǎng)降甲烷效果，并分析有效成分的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

①不同處理鳳仙花均能有效降低CH4產(chǎn)生，促進(jìn)NH3－N向MCP轉(zhuǎn)化，添加量高(2.5%)時(shí)效果更明顯。

②比較水浸提液、乙醇浸提液和固體粉劑體外培養(yǎng)效果，固體粉劑最好。

③鳳仙花有望成為新的降CH4植物。

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