硫辛酸對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和免疫功能的影響

規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖為肉雞生產(chǎn)做出重要貢獻(xiàn)的同時(shí)，也帶來了嚴(yán)重的隱患，如肉雞體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基、發(fā)生氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為免疫機(jī)能低下、疾病易感性增加等［1］。生長(zhǎng)期是肉雞機(jī)體的各項(xiàng)功能趨于完善的重要時(shí)期。因此，提高生長(zhǎng)期肉雞抗氧化能力和免疫功能對(duì)減少集約化養(yǎng)殖下肉雞疾病的發(fā)生以及藥物的使用具有重要的意義?？寡趸瘎鳛樽杂苫那宄齽?，可以協(xié)助體內(nèi)維持氧代謝平衡，提高機(jī)體抗氧化能力，同時(shí)維持重要免疫細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)完整性，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能［2－3］。硫辛酸，是唯一兼具脂溶性與水溶性的的抗氧化劑，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，它可以通過螯合金屬離子、清除自由基、再生內(nèi)源性抗氧化劑來減緩或修復(fù)氧化損傷，也被稱為“萬能抗氧化劑”［4］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于硫辛酸的研究主要集中在人類疾病等的治療和預(yù)防方面，有關(guān)硫辛酸在畜禽飼養(yǎng)和免疫方面的研究報(bào)道還較少［5－6］。為此，本試驗(yàn)以21日齡黃羽肉雞為試驗(yàn)動(dòng)物，旨在通過研究硫辛酸對(duì)其生長(zhǎng)性能、抗氧化能力及免疫功能的影響，為硫辛酸在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料

試驗(yàn)選用21日齡體重相近的矮腳黃羽肉雞60只，隨機(jī)分成2組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組(硫辛酸組)飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸的試驗(yàn)飼糧，試驗(yàn)期30 d。

硫辛酸由江蘇省常熟市富士萊醫(yī)藥化工有限公司提供，純度為99%。

矮腳黃羽肉雞由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)場(chǎng)提供。

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧參照美國(guó)NRC(1994)家禽營(yíng)養(yǎng)需要量配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(air－dry basis) %

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet:VA 12 000 IU，VD31 000 IU，VE 60 mg，VB23.0 mg，VB1215 μg，煙酸 nicotinic acid 30 mg，葉酸 folic acid 0.55 mg，生物素 biotin 0.15 mg，泛酸 pantothenic acid 10 mg，膽堿 choline 400 mg，F(xiàn)e 80 mg，Mn 60 mg，Cu 8 mg，Zn 40 mg，Se 0.15 mg，I 0.7 mg。

2)計(jì)算值 Calculated values。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞采用舍內(nèi)籠養(yǎng)方式，自由采食和飲水。按正常程序防疫和雞舍消毒。

1.3 樣品采集與制備

1.3.1血液的采集與樣品制備

分別于試驗(yàn)第15天和第30天，每個(gè)重復(fù)挑選與該重復(fù)平均體重相近的肉雞1只，翅靜脈采集2管(不含肝素鋰和含肝素鋰)分別為3 mL的血樣，其中不含肝素鋰血樣于3 000 r/min離心15 min制備血清，放入EP管中，置于4℃冰箱保存，用于血清抗氧化指標(biāo)及免疫指標(biāo)的測(cè)定;含肝素鋰血樣為抗凝血，用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定。1.3.2 免疫器官采集

分別于試驗(yàn)第15天和第30天，每個(gè)重復(fù)挑選與該重復(fù)平均體重相近的肉雞1只，屠宰，收集脾臟、胸腺和法氏囊，稱重，用于計(jì)算免疫器官指數(shù)。

1.4 測(cè)試指標(biāo)和方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)期間每天記錄雞只死亡情況，以重復(fù)為單位記錄每日投料量和剩余料量，分別于試驗(yàn)第15天和第30天09:00對(duì)試驗(yàn)雞(禁食12 h)進(jìn)行稱重，并計(jì)算各組死亡率、平均采食量、平均日增重和料重比。

1.4.2 抗氧化能力

血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)活性、總超氧化物歧化酶(T－SOD)活性、總抗氧化能力(TAOC)以及丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、過氧化氫(H2O2)含量、抑制羥自由基(·OH)能力均使用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 免疫功能

1.4.3.1 免疫器官指數(shù)

免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官重量(g)/

肉雞活體重(kg)。1.4.3.2 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

將抗凝血先用無鈣鎂Hank’s液作1∶1稀釋，然后移取3 mL人淋巴細(xì)胞分離液于10 mL離心管中，沿管壁緩慢加入2倍體積的稀釋血液，2 500 r/min離心 30 min。取中間白細(xì)胞層約1 mL，加入3～5倍 RPMI－1640完全培養(yǎng)液，洗滌3次，每次2 000 r/min離心10 min，棄上清。將190 μL的淋巴細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)液中，再加入含10 μL的伴刀豆球蛋白A(ConA)或10 μL的脂多糖(LPS)溶液，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品留2個(gè)孔作空白對(duì)照，培養(yǎng)體系每孔共200 μL。于 5%CO2、39 ℃ 下培養(yǎng) 72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加5 mg/mL噻唑藍(lán)(MTT)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，每孔再加入100 μL 10%十二烷基磺酸鈉(SDS)－0.04 mol/L氯化氫(HCl)溶液，30 min后用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=絲裂原刺激孔OD570nm/

對(duì)照孔OD570nm。

1.4.3.3 血清免疫球蛋白

血清免疫球蛋白 A(IgA)、免疫球蛋白 M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)含量均采用免疫比濁法進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 13.0軟件的 One－way ANOVA程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，分別以P＜0.05、P＜0.01作為差異顯著與極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可以看出，與對(duì)照組相比，硫辛酸對(duì)2個(gè)階段的黃羽肉雞平均日采食量、平均日增重、料重比均無顯著影響(P＞0.05)。

表2 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of lipoic acid on growth performance of yellow－feathered broilers

同行同一階段中的數(shù)據(jù)肩注小寫字母不同表示差異顯著(P＜0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(P＜0.01)，無肩注表示差異不顯著(P＞0.05)。下表同。

In the same row，values in the same period with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference(P＜0.01)，while without letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

2.2 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞抗氧化能力的影響

由表3可見，在試驗(yàn)第15天時(shí)，與對(duì)照組相比，硫辛酸組黃羽肉雞血清 T－SOD活性升高了19.57%(P＜0.05)，NO含量下降了 16.64%(P＜0.05)。

在試驗(yàn)第30天時(shí)，與對(duì)照組相比，硫辛酸組黃羽肉雞血清抑制羥自由基能力提高了562.56%(P＜0.01)，MDA含量降低了20.98%(P＜0.05)。

2.3 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響

由表4可以看出，在試驗(yàn)第15天時(shí)，與對(duì)照組相比，硫辛酸組黃羽肉雞脾臟指數(shù)提高了29.86%(P＜0.05)。

在試驗(yàn)第30天時(shí)，與對(duì)照組相比，硫辛酸對(duì)黃羽肉雞脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)均無顯著影響(P＞0.05)。

2.4 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

由表5可知，在試驗(yàn)第15天時(shí)，與對(duì)照組相比，硫辛酸對(duì)由ConA和LPS刺激的黃羽肉雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均無顯著影響(P＞0.05);在試驗(yàn)第30天時(shí)，二者分別提高了16.83%和19.79%(P＜0.05)。

2.5 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞血清免疫球蛋白含量的影響

由表6可以看出，在試驗(yàn)第15天時(shí)，與對(duì)照組相比，硫辛酸組黃羽肉雞血清IgG含量提高了34.03%(P＜0.01)。

在試驗(yàn)第30天時(shí)，與對(duì)照組相比，硫辛酸組黃羽肉雞IgG含量提高了29.40%(P＜0.05)。

3 討論

3.1 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響

Zhang等［7］研究表明，飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸對(duì)愛拔益加肉雞生長(zhǎng)性能無顯著影響(P＞0.05)，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。Srilatha等［8］研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加20、40、60 mg/kg硫辛酸對(duì)肉雞日增重、料重比均無顯著影響(P＞0.05)。在本試驗(yàn)中，飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸對(duì)整個(gè)試驗(yàn)期間黃羽肉雞平均日采食量、平均日增重、料重比均無顯著影響(P＞0.05)，這與已有研究結(jié)果相似。

表3 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞血清抗氧化能力的影響Table 3 Effects of lipoic acid on serum antioxidant capacity in yellow－feathered broilers

表4 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響Table 4 Effects of lipoic acid on immune organ indices in yellow－feathered broilers g/kg

表5 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響Table 5 Effects of lipoic acid on lymphocyte transformation rate in peripheral blood in yellow－feathered broilers

3.2 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞抗氧化能力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是機(jī)體清除自由基的一種重要酶，T－SOD活性的高低間接反映了機(jī)體清除自由基的能力。GSH－Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物酶，它能催化還原型谷胱甘肽(GSH)變?yōu)檠趸凸入赘孰?GSSG)，使有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受過氧化物的干擾及損害。脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物之一是MDA，血清中MDA含量的高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的嚴(yán)重程度。試驗(yàn)動(dòng)物在服用抗氧化劑一段時(shí)間后，可以通過測(cè)定血清或組織中SOD活性、GSH－Px活性、MDA含量等的變化來判斷抗氧 化劑的作用效果［9］。

表6 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞血清中免疫球蛋白含量的影響Table 6 Effects of lipoic acid on serum immunoglobulin content in yellow－feathered broilers μg/mL

目前，硫辛酸的抗氧化功能已經(jīng)得到證實(shí)。Zhang等［7］研究表明，飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可以顯著降低愛拔益加肉雞血清MDA含量(P＜0.01);李建文等［10］研究也發(fā)現(xiàn)，肉鴨飼糧中添加150 mg/kg硫辛酸有提高其血漿GSH－Px活性的趨勢(shì)(P=0.077)，可以顯著降低其肝臟MDA含量(P＜0.05)。在本試驗(yàn)第15天時(shí)，硫辛酸組黃羽肉雞血清T－SOD活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);在第30天時(shí)，硫辛酸組黃羽肉雞血清MDA含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，由此可初步判定300 mg/kg硫辛酸可以在一定程度上改善黃羽肉雞機(jī)體的抗氧化能力。

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的提高，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)自由基過量產(chǎn)生，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化損傷，誘導(dǎo)各種疾病的發(fā)生?？寡趸瘎┳鳛樽杂苫那宄齽?，可以抑制或減緩自由基或自由基所產(chǎn)生的連鎖反應(yīng)化合物的生成，達(dá)到修復(fù)機(jī)體氧化損傷的作用。因此，自由基的水平也從側(cè)面反映了抗氧化劑抗氧化能力的強(qiáng)弱［11］。NO作為一種氮自由基，攜帶有1個(gè)未配對(duì)電子，極易與氧、超氧陰離子、過氧化氫反應(yīng)生成 NO3－和NO2－。其中NO3－容易質(zhì)子化后迅速分解成具有高反應(yīng)性的羥自由基，誘發(fā)生物膜的多種不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化作用，造成細(xì)胞損傷［12］。在本試驗(yàn)中，第15天硫辛酸組黃羽肉雞血清NO含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，表明硫辛酸的添加可以在黃羽肉雞21～35日齡顯著減少NO的產(chǎn)生，進(jìn)而減緩脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生，保護(hù)機(jī)體組織不受損傷。羥自由基則是人體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的自由基，它可以使組織中的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化，遭受氧化性損傷和破壞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、壞死或突變［13］。抑制羥自由基的能力可以間接反映羥自由基的活性，二者之間為反相關(guān)系。即抑制羥自由基能力越強(qiáng)，羥自由基活性越弱;抑制羥自由基能力越弱，羥自由基活性越強(qiáng)。在本試驗(yàn)中，第30天時(shí)，硫辛酸組黃羽肉雞血清抑制羥自由基能力顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，說明硫辛酸的添加可以顯著降低血清中羥自由基的活性，保護(hù)機(jī)體免受損傷。

從以上結(jié)果可以看出，硫辛酸作為抗氧化劑可以在一定程度上清除機(jī)體自由基，提高肉雞抗氧化水平。

3.3 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞免疫功能的影響

3.3.1 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響

脾臟、胸腺、法氏囊作為禽類主要免疫器官，在機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫中發(fā)揮了極其重要的作用。脾臟是禽類最大的外周免疫器官，聚居著大量B細(xì)胞、T細(xì)胞，是免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所。同時(shí)也是體內(nèi)產(chǎn)生抗體的主要器官，參與全身細(xì)胞免疫和體液免疫。胸腺和法氏囊是禽類的中樞免疫器官，前者主要負(fù)責(zé)T細(xì)胞的成熟和分化，后者則是B細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的部位，主要參與體液免疫。中樞和外周免疫器官發(fā)育狀態(tài)及其機(jī)能強(qiáng)弱直接決定著禽類全身的免疫水平［14］。Rivas等［15］認(rèn)為，脾臟、胸腺及法氏囊的重量可用于評(píng)價(jià)雛雞的免疫狀態(tài)，其絕對(duì)重量和相對(duì)重量越大，說明機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)能越強(qiáng)。在本試驗(yàn)第15天時(shí)，硫辛酸可以促進(jìn)脾臟和胸腺的發(fā)育，其中對(duì)脾臟發(fā)育的影響顯著(P＜0.05)，表明硫辛酸可以在一定程度上促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，進(jìn)而提高機(jī)體免疫水平。

3.3.2 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞細(xì)胞免疫的影響

硫辛酸作為唯一一個(gè)脂水兼溶的抗氧化劑，在水相和脂質(zhì)中都有較好的溶解性，可以以相當(dāng)高的濃度存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外，發(fā)揮清除脂溶性和水溶性自由基的作用，從而保護(hù)脂蛋白及細(xì)胞膜，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的完整性，進(jìn)而提高細(xì)胞免疫功 能。Srilatha 等［8］發(fā) 現(xiàn)，飼 糧 中 添 加 60、80 mg/kg硫辛酸均可顯著刺激肉雞皮膚嗜堿性粒細(xì)胞過敏反應(yīng)(P＜0.05);崔玨等［16］研究也發(fā)現(xiàn)，高脂飼糧中添加0.1%硫辛酸可以顯著提高小鼠外周血CD4+/CD8+、B細(xì)胞百分含量(P＜0.05)，進(jìn)而有效改善慢性氧化應(yīng)激對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷，這表明飼糧中添加一定量的硫辛酸可以提高動(dòng)物細(xì)胞免疫水平。檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率也是細(xì)胞免疫研究的一種常用方法。ConA和LPS是常用來檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的絲裂原，作為促分裂因子來檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，其轉(zhuǎn)化率的高低常作為衡量機(jī)體細(xì)胞免疫水平的指標(biāo)。其中ConA選擇性地刺激T細(xì)胞，而LPS只刺激B細(xì)胞［17］。在本試驗(yàn)中，第30天時(shí)，硫辛酸組黃羽肉雞由ConA、LPS刺激的外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，表明300 mg/kg硫辛酸可以在黃羽肉雞21～35日齡顯著提高其細(xì)胞免疫水平。

3.3.3 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞體液免疫的影響

免疫球蛋白是具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似的球蛋白，是一類重要的免疫效應(yīng)分子。家禽主要含有 IgA、IgM、IgG 3種免疫球蛋白。IgA具有抗菌、抗毒、抗病毒作用，占血清免疫球蛋白的10%～20%。IgG是人和動(dòng)物血清中含量最高的免疫球蛋白，占血清免疫球蛋白總量的75%～80%，同時(shí)它也是再次免疫所產(chǎn)生的免疫球蛋白，在體液免疫中最為重要。IgM是分子量最大的免疫球蛋白，是初次體液反應(yīng)早期階段產(chǎn)生的主要的免疫球蛋白，但持續(xù)時(shí)間短，其含量?jī)H占血清免疫球蛋白的10%左右［18］。在本試驗(yàn)中，硫辛酸組黃羽肉雞IgG含量在整個(gè)試驗(yàn)期間均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。作為體液免疫中最重要的免疫球蛋白，IgG含量的提高表明飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可以增強(qiáng)肉雞體液免疫功能。

4 結(jié)論

①飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸對(duì)黃羽肉雞的生長(zhǎng)性能無顯著影響。

②飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可抑制黃羽肉雞體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，在一定程度上提高機(jī)體的抗氧化能力。

③飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可以通過提高黃羽肉雞細(xì)胞免疫和體液免疫水平，進(jìn)而改善其免疫功能。

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