殼寡糖對(duì)虹鱒生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及非特異性免疫功能的影響

劉含亮 孫敏敏 王紅衛(wèi) 萬(wàn)文菊 王紀(jì)亭*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271000;2.泰山醫(yī)學(xué)院，泰安 271000)

開發(fā)利用具有無(wú)污染、無(wú)殘留、不產(chǎn)生耐藥性特點(diǎn)，同時(shí)可提高動(dòng)物機(jī)體抵抗能力，預(yù)防動(dòng)物疾病的綠色環(huán)保型促生長(zhǎng)飼料添加劑已經(jīng)成為飼料業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。素有“人體第六生命要素”、“軟黃金”之美譽(yù)的甲殼素(又稱幾丁質(zhì))廣泛存在于海產(chǎn)品和絲狀菌類中，但由于其不溶于水，在開發(fā)應(yīng)用上受到了很大的限制。殼寡糖(又稱寡聚氨基葡糖、甲殼低聚糖)由甲殼素脫乙酰化的產(chǎn)物殼聚糖降解獲得，是由2～10個(gè)氨基葡萄糖通過(guò)β－1，4－糖苷鍵連接而成的低聚糖［1］。殼寡糖是天然糖中唯一大量存在的帶正電荷的堿性氨基多糖，水溶性好，可通過(guò)動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞直接被吸收。殼寡糖以功能性食品形式早已應(yīng)用于食品工業(yè)中，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中也被作為新型的飼料添加劑廣泛運(yùn)用。王秀武等［2］報(bào)道，殼寡糖可抑制肉仔雞腸道有害菌的增殖，促進(jìn)微絨毛生長(zhǎng)發(fā)育，提高免疫能力和生產(chǎn)性能。馬利等［3］研究表明，飼料中添加殼寡糖能夠促進(jìn)南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)，降低機(jī)體脂肪和膽固醇沉積，維護(hù)各個(gè)器官功能的正常。雖然水產(chǎn)飼料中添加殼寡糖并運(yùn)用于養(yǎng)殖過(guò)程的已有較多報(bào)道，但大多都局限于促生長(zhǎng)效果的研究。作為低等的脊椎動(dòng)物，魚類主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)來(lái)抵抗病原的入侵［4］，非特異性免疫防御機(jī)制是魚類抵抗病原的第1道屏障。本試驗(yàn)通過(guò)在飼料中添加不同劑量的殼寡糖，研究其對(duì)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和非特異性免疫功能的影響，旨在為殼寡糖在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用殼寡糖(脫乙酰度＞90%)購(gòu)自濟(jì)南海得貝生物工程有限公司，以水產(chǎn)動(dòng)物甲殼為原料，采用酶法制備，分子質(zhì)量為3 000 u。

1.2 試驗(yàn)飼料

以小麥、豆粕、魚粉為主要原料，按照 NRC(1993)魚類營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制基礎(chǔ)飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對(duì)照組)、100、200和400 mg/kg的殼寡糖，配制成4種試驗(yàn)飼料。飼料原料經(jīng)粉碎(40目以上)后加水?dāng)D壓成粒徑為1.5～2.5 mm的顆粒料，自然晾干后備用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(air－dry basis) %

1)預(yù)混料為每千克飼料提供 Premix provided the following per kg of diet:VC 800 mg，VA 12 000 IU，VD33 000 IU，VE 80 mg，VK 7 mg，VB120 mg，VB240 mg，VB620 mg，VB120.8 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 60 mg，煙酸 nicotinic acid 215 mg，葉酸 folic acid 10 mg，肌醇 inositol 1 200 mg，生物素 biotin 3.0 mg，氯化膽堿 choline chloride 2 g，抗氧化劑 antioxidant 200 mg，甜菜堿 betaine 1.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 100 mg，CuSO4·5H2O 20 mg，MnSO4·H2O 67 mg，KI 0.59 mg，MgSO4·7H2O 9.28 g。

2)計(jì)算值 Calculated values。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選用體重約為60 g的虹鱒480尾，隨機(jī)分為4組(每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾)，分別飼喂在基礎(chǔ)飼料中添加0、100、200和400 mg/kg殼寡糖的試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)魚以重復(fù)為單位放養(yǎng)于水族箱中，水族箱的規(guī)格為0.30 m3，水體積為0.25 m3。

按照常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行，試驗(yàn)開始前用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)1周，日投喂量為試驗(yàn)魚體重的2% ～4%，每天分別在09:00、14:00各投喂1次，根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)整投喂量。試驗(yàn)期間水溫為(15.5±2.0)℃，溶氧為(8.2±1.1)mg/L。試驗(yàn)期為49 d。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

特定生長(zhǎng)率(specific growth rate，SGR，%/d)=

100×［ln初重－ln末重］/試驗(yàn)天數(shù);增重率(weight gain rate，WGR，%)=

100×(初重－末重)/初重;

飼料系數(shù)(feed conversion rate，F(xiàn)CR)=

(投料量－殘料量)/(死亡個(gè)體重+末重－初重);蛋白質(zhì)效率(protein efficiency rate，PER，%)=100×魚體凈增重/(飼料攝取量×蛋白質(zhì)含量)。1.4.2 血清生化指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束次日，每重復(fù)隨機(jī)取4尾魚，從尾靜脈采血，室溫放置60 min后，3 000 r/min離心10 min，將4尾魚的離心上清液混合，制備待測(cè)血清樣。血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、甘油三酯、膽固醇含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.4.3 非特異性免疫指標(biāo)

1.4.3.1 白細(xì)胞吞噬能力的測(cè)定

參照王軍等［5］的方法進(jìn)行，具體操作如下:1)每重復(fù)隨機(jī)取4尾魚，用無(wú)菌注射器從尾動(dòng)脈采血適量，將每個(gè)重復(fù)4尾魚所采的血液混合成1個(gè)樣品，立即吸取2滴于盛有0.02 mL肝素(0.5%)的潔凈凹玻片的凹孔內(nèi)，輕輕攪動(dòng)混勻;2)用滴管加1滴金黃色葡萄球菌菌液(濃度為6×108個(gè)/mL)于凹孔內(nèi)，充分混勻;3)將凹玻片置于有數(shù)層濕紗布的預(yù)溫帶蓋容器內(nèi)，37℃溫育30 min;4)以2 000 r/min離心10 min，吸取血漿與紅細(xì)胞交界面的白細(xì)胞做血涂片，每個(gè)血樣做2張涂片，自然晾干;5)滴加甲醇固定3～4 min，用水沖洗后自然晾干;6)用姬姆薩染色2～3 min，用水沖洗后自然晾干;7)將制備好的血涂片置于顯微鏡油鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)多形核白細(xì)胞中吞噬有細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)，即為吞噬百分率(%)，再數(shù)此100個(gè)多形核白細(xì)胞中所吞噬的細(xì)菌總數(shù)，除以100，得出每個(gè)細(xì)胞吞噬細(xì)菌數(shù)的平均值，即為吞噬指數(shù)。

1.4.3.2 血清殺菌能力的測(cè)定

參照 Rainger等［6］、Ourth 等［7］及秦啟偉等［8］的方法進(jìn)行，具體操作如下:1)每重復(fù)隨機(jī)取4尾魚，用無(wú)菌注射器從尾動(dòng)脈采血適量，將每個(gè)重復(fù)4尾魚所采的血液混合成1個(gè)樣品，血液經(jīng)1 000 r/min離心5 min，制備血清;2)將創(chuàng)傷弧菌28℃培養(yǎng)24 h后，用0.85%氯化鈉溶液洗滌并調(diào)整細(xì)菌濃度至1×106個(gè)/mL;3)取200 μL新鮮血清混合于200 μL細(xì)菌懸液中，28℃下溫育1 h;4)取細(xì)菌和血清混合物培養(yǎng)于溫?zé)岬拇蠖估业鞍篆傊囵B(yǎng)基(TSA)平板中，28℃下培養(yǎng)24 h后計(jì)算平板中菌落形成單位(colony forming units，CFUs);5)以0.85%NaCl溶液作為對(duì)照，計(jì)算血清的殺菌百分率。

血清的殺菌百分率計(jì)算公式如下:殺菌百分率(%)=100×(1－試驗(yàn)平板中菌落

形成單位/對(duì)照平板中菌落形成單位)。

1.4.3.3 血清、肝臟和鰓中溶菌酶活性的測(cè)定

參照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，具體操作如下:1)血清制備。每個(gè)重復(fù)選取3尾魚，用無(wú)菌注射器從心臟采血，放于4℃靜置4 h，然后4 000 r/min離心10 min，取上清液用于測(cè)定溶菌酶活性。2)肝臟、鰓組織勻漿液制備。分別取試驗(yàn)魚肝、鰓組織各5 g，置于平皿中，剪碎后置于勻漿器中并加入1倍體積的0.1 mol/L磷酸鉀鹽緩沖液，充分勻漿且反復(fù)凍融數(shù)次后勻漿液經(jīng)5 000 r/min離心15 min，取上清液用于測(cè)定溶菌酶活性。3)采用比濁法測(cè)定溶菌酶活性。

樣品中溶菌酶活性的計(jì)算公式如下:溶菌酶活性(U/mL或U/g)=［(樣品Tt值－樣品To值)/(標(biāo)準(zhǔn)品Tt值－標(biāo)準(zhǔn)品To值)］×

標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

式中:Tt值為At值(340 nm下5 min后的吸光度值)換算出的透光度值;To值為Ao值(340 nm下初始時(shí)的吸光度值)換算出的透光度值。

1.4.4 體成分

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每重復(fù)隨機(jī)取3尾魚，測(cè)定全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量。全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量分別采用恒溫烘干失水法、微量凱氏定氮法、索氏抽提法和高溫灼燒法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間若有顯著差異，則進(jìn)行Duncan氏多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對(duì)虹鱒生長(zhǎng)性能的影響

由表 2可知，與對(duì)照組相比，100、200和400 mg/kg殼寡糖組的特定生長(zhǎng)率分別提高了5.60%(P ＜0.05)、15.89%(P ＜0.05)和18.69%(P＜0.05)，增重率分別提高了7.53%(P＜0.05)、21.21%(P＜0.05)和 26.02%(P＜0.05)，蛋白質(zhì)效率分別提高了0.60%(P＞0.05)、7.02%(P ＞0.05)和9.79%(P ＜0.05)，飼料系數(shù)分別降低了0.60%(P＞0.05)、6.55%(P＞0.05)和8.93%(P＜0.05)。200和400 mg/kg殼寡糖組的特定生長(zhǎng)率、增重率、飼料系數(shù)和蛋白質(zhì)效率均差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 殼寡糖對(duì)虹鱒血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，虹鱒飼料中添加殼寡糖提高了血清總蛋白、白蛋白、球蛋白含量，降低了血清膽固醇、甘油三酯、葡萄糖含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，但均未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。

2.3 殼寡糖對(duì)虹鱒非特異性免疫功能的影響

2.3.1 殼寡糖對(duì)虹鱒白細(xì)胞吞噬能力的影響

由表4可知，200和400 mg/kg殼寡糖組較對(duì)照組和100 mg/kg殼寡糖組顯著提高了白細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)(P＜0.05)，但200和400 mg/kg殼寡糖組之間差異不顯著(P＞0.05)，100 mg/kg殼寡糖組與對(duì)照組之間差異也不顯著(P＞0.05)。

2.3.2 殼寡糖對(duì)虹鱒血清殺菌能力的影響

由表5可知，血清殺菌百分率隨殼寡糖添加水平的增加而提高，200和400 mg/kg殼寡糖組極顯著高于對(duì)照組和100 mg/kg殼寡糖組(P＜0.01)，100 mg/kg殼寡糖組極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，但200和400 mg/kg殼寡糖組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表2 殼寡糖對(duì)虹鱒生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of chito－oligosaccharides on growth performance of rainbow trout

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)。下表同。

In the same row，values with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，and with different capital letter superscripts mean significant difference(P＜0.01).The same as below.

表3 殼寡糖對(duì)虹鱒血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of chito－oligosaccharides on serum biochemical indices of rainbow trout

表4 殼寡糖對(duì)虹鱒白細(xì)胞吞噬能力的影響Table 4 Effects of chito－oligosaccharides on leucocyte phagocytic ability of rainbow trout

表5 殼寡糖對(duì)虹鱒血清殺菌能力的影響Table 5 Effects of chito－oligosaccharides on serum bactericidal ability of rainbow trout%

2.3.3 殼寡糖對(duì)虹鱒血清、肝臟和鰓中溶菌酶活性的影響

由表6可知，200和400 mg/kg殼寡糖組較對(duì)照組和100 mg/kg殼寡糖組顯著提高了血清和肝臟中溶菌酶活性(P＜0.05)，但200和400 mg/kg殼寡糖組之間差異不顯著(P＞0.05)，100 mg/kg殼寡糖組與對(duì)照組之間差異也不顯著(P＞0.05)。隨著殼寡糖添加水平的增加，鰓中溶菌酶活性顯著增加(P＜0.05)。

表6 殼寡糖對(duì)虹鱒血清、肝臟和鰓中溶菌酶活性的影響Table 6 Effects of chito－oligosaccharides on lysozyme activity in serum，liver and gill of rainbow trout

2.4 殼寡糖對(duì)虹鱒體成分的影響

由表7可知，殼寡糖對(duì)虹鱒全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分含量均沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)。

表7 殼寡糖對(duì)虹鱒體成分的影響Table 7 Effects of chito－oligosaccharides on body composition of rainbow trout %

3 討論

3.1 殼寡糖對(duì)虹鱒生長(zhǎng)性能的影響

Refstie等［9］給大西洋鮭魚分別飼喂不含和含大豆寡糖的飼料55 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂含大豆寡糖飼料的試驗(yàn)組大西洋鮭魚在增重率、飼料轉(zhuǎn)化率以及蛋白質(zhì)和脂肪消化率等方面均優(yōu)于對(duì)照組。劉興國(guó)等［10］在羅非魚的飼料中分別添加0.25%、0.50%、1.00%、2.00%的殼聚糖(甲殼素酶解所得，分子質(zhì)量大于殼寡糖)，結(jié)果表明，殼聚糖顯著降低了羅非魚的飼料系數(shù)，提高了蛋白質(zhì)效率，添加量以0.50%最為適宜。曹丹等［11］在異育銀鯽飼料中分別添加0、1.0%、1.5%、2.0%的殼聚糖，飼喂60 d后發(fā)現(xiàn)，各試驗(yàn)組的增重率均比對(duì)照組顯著提高，且以1.0%添加組提高最多。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加100、200和400 mg/kg殼寡糖均提高了虹鱒的特定生長(zhǎng)率、增重率和蛋白質(zhì)效率，降低了飼料系數(shù)，表明飼料中添加殼寡糖對(duì)虹鱒的生長(zhǎng)有良好的促進(jìn)作用。寡糖主要通過(guò)以下途徑對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能產(chǎn)生影響:1)促進(jìn)礦物元素的吸收。寡糖發(fā)酵產(chǎn)生的酸性物質(zhì)能吸附鈣化合物使其溶解性增加，從而導(dǎo)致鈣吸收能力增強(qiáng)。2)生成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。寡糖可促進(jìn)有益菌如雙歧桿菌等的大量增殖，而雙歧桿菌在腸道能合成維生素 B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素 B12、煙酸、葉酸以及各種氨基酸［12］。

3.2 殼寡糖對(duì)虹鱒血清生化指標(biāo)的影響

寡糖能夠降低血清中甘油三酯和膽固醇含量，進(jìn)而改善脂類代謝;能夠降低血清中的尿素氮含量，提高蛋白質(zhì)沉積率;同時(shí)還能夠降低尿素在腎臟中的沉積，從而減少腎臟尿素中毒的可能性。此外，寡糖的添加還對(duì)血清中的免疫球蛋白含量、生長(zhǎng)激素水平以及谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性等有一定的影響。血清轉(zhuǎn)氨酶在氨基酸代謝和蛋白質(zhì)、脂肪和糖三者相互轉(zhuǎn)化的過(guò)程中起著極其重要的作用，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的升高常反映肝功能發(fā)生障礙，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的升高常反映心臟或肌肉組織功能發(fā)生障礙［13］;血清葡萄糖含量可作為機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況的指標(biāo)，含量較高時(shí)表現(xiàn)為魚類積極攝食，健康狀態(tài)良好。這些血清生化指標(biāo)的變化可直接或間接地反映出殼寡糖投喂后對(duì)魚類生長(zhǎng)、代謝的影響。馬利等［3］在南美白對(duì)蝦飼料 中 分 別 添 加 殼 寡 糖 0、125、250、500、1 000 mg/kg，飼喂8周后發(fā)現(xiàn)，殼寡糖對(duì)南美白對(duì)蝦血清中肌酐、葡萄糖、鈣離子、總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇含量均無(wú)顯著影響，但可使高密度脂蛋白膽固醇含量顯著增加，促進(jìn)脂類代謝。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加殼寡糖提高了虹鱒血清總蛋白、白蛋白、球蛋白的含量，降低了血清甘油三酯、膽固醇、葡萄糖含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，但均未達(dá)到顯著水平，說(shuō)明殼寡糖提高了飼料蛋白質(zhì)在體內(nèi)的沉積，同時(shí)也體現(xiàn)了虹鱒魚體的健康水平。

3.3 殼寡糖對(duì)虹鱒非特異性免疫功能的影響

魚類是較低等的脊椎動(dòng)物，非特異免疫在魚類的免疫防御中發(fā)揮著重要作用。魚類抗傳染免疫中主要靠體液免疫和細(xì)胞免疫，在細(xì)胞免疫中，血液中的白細(xì)胞起著重要的作用。血清溶菌酶活性是魚類機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)，其活性的升高表明巨噬細(xì)胞、多型核白細(xì)胞的吞噬活性加強(qiáng)。因此，通過(guò)測(cè)定魚類血液中白細(xì)胞數(shù)量和吞噬能力以及肝臟等組織中的溶菌酶活性，可以反映出被測(cè)魚類機(jī)體的免疫狀態(tài)。本研究結(jié)果表明，飼料中添加200和400 mg/kg殼寡糖后虹鱒的非特異性免疫功能得到顯著改善。Claire等［14］將健康鯉魚飼養(yǎng)于殼聚糖濃度為150 mg/L的水中作為試驗(yàn)組，正常飼養(yǎng)96 h后采集鯉魚的肝臟、頭腎組織，測(cè)其抗體水平，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的總抗體量顯著高于對(duì)照組;此外，將寄生有Ptychobothrium sp.(Cestoda)的鯉魚飼養(yǎng)于殼聚糖和銅離子濃度分別為75.0和0.1 mg/L的水中作為試驗(yàn)組，檢測(cè)結(jié)果仍是試驗(yàn)組的總抗體量顯著高于對(duì)照組。王樹芹等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在異育銀鯽飼料中添加0.5%或1.0%的殼聚糖能夠提高血清溶菌酶活性和白細(xì)胞的吞噬能力。沈錦玉等［16］研究發(fā)現(xiàn)，給中華絨螯蟹注射或口服殼聚糖可顯著提高其血清中溶菌酶、超氧化物歧化酶活性。寡糖提高機(jī)體免疫功能的可能機(jī)制有:1)寡糖本身具有一定的免疫原性，能夠刺激機(jī)體免疫應(yīng)答［17］;2)寡糖分子與存在于腸內(nèi)皮細(xì)胞上的有害微生物的受體結(jié)構(gòu)相似，能與一定的毒素、病毒和真菌細(xì)胞的表面結(jié)合，可作為外源抗原的佐劑減緩抗原的吸收，增加抗原的效價(jià)，從而增強(qiáng)動(dòng)物體的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)［18］;3)寡糖可促進(jìn)有益菌如雙歧桿菌等的大量增殖，而雙歧桿菌可以提高機(jī)體的抗體水平，激活巨噬細(xì)胞的吞噬活性，從而影響機(jī)體的免疫功能［19］。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，飼料中添加殼寡糖可提高虹鱒的生長(zhǎng)性能和非特異性免疫功能，建議添加量為200 mg/kg。

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