抗藍舌病病毒VP6和VP7蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

魏 鵬，孫恩成，劉霓紅，楊 濤,2，徐青元，秦永麗，趙 晶，馮瑜菲,2，王文世，張翠云,3，吳東來*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖南長沙 410128）

藍舌?。˙luetongue，BT）是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬藍舌病病毒（BTV）引起的經(jīng)媒介昆蟲（如庫蠓、伊蚊等）傳播的動物傳染病。易感動物主要為山羊、綿羊、牛、駱駝等反芻動物，病畜有高燒、黏膜水腫和糜爛等癥狀。該病致死率為20%～30%，有時甚至高達90%。BTV血清型眾多，已鑒定有24個血清型存在。近年來又發(fā)現(xiàn)了兩個新的血清型，BTV25（瑞士，2008年）和 BTV26（科威特，2011年）[1]。根據(jù)不同血清型的Seg-2序列不同，可以將這些血清型又分為若干個核酸亞型（核酸A型到 L 型）[1]。

BTV是迄今為止發(fā)現(xiàn)的分子量最大的RNA病毒[2]，其基因組由10個雙股正鏈RNA組成；3個大節(jié)段（L1～L3），3個中節(jié)段（M 4～M 6）和4個小節(jié)段（S7～S10），10個節(jié)段基因組分別編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP7）和 4種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3a、NS3b）[3]。VP6蛋白由S9基因編碼，被認為是BTV的解旋酶[4]，全長328個氨基酸。VP6蛋白具有高度的免疫原性，可以誘導(dǎo)高滴度的特異性抗體產(chǎn)生[5]。VP7蛋白由S7基因編碼，是BTV群特異性抗原蛋白，由349個氨基酸組成，約占核心蛋白總量的36%[6-7]。制備針對VP6和VP7蛋白的單克隆抗體（MAb）對研究這兩種蛋白的生物學(xué)特性和建立BT的檢測方法具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細胞、重組質(zhì)粒及實驗動物 BTV血清型1～24型病毒株、BHK-21細胞和SP2/0骨髓瘤細胞由本實驗室保存；以pCI-neo質(zhì)粒為載體的分別含有BTV1 10個蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6、VP7、NS1、NS2、NS3）編碼基因的真核表達重組質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建；6周齡～8周齡BALB/c雌性小鼠購自本研究所實驗動物中心。

1.2 主要試劑 預(yù)染蛋白Marker購自Fermentas公司；鄰苯二胺（OPD）購自哈爾濱博瑞生物技術(shù)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體（HRP-IgG）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PEG 4000、HAT、HT、FITC標記羊抗鼠IgG抗體（FITC-IgG）購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectam ineTM2000、MAb亞型鑒定試劑盒購自Invitrogen公司。

1.3 動物免疫 腹腔注射BTV1（TCID50=10-6.675/0.1m L）于6周齡～8周齡的BALB/c雌鼠5只，1 ML/只。每兩周進行一次腹腔免疫，共免疫4次。在三免后一周斷尾采血，采用BTV1病毒包被的ELISA板檢測血清效價。選取血清效價最高的小鼠在融合前3 d腹腔注射加強免疫。

1.4 ELISA檢測方法的建立 按常規(guī)間接ELISA操作步驟，分別用滅活的BTV1全病毒和BHK-21作為抗原包被，經(jīng)方陣滴定試驗確定抗原最佳包被濃度、待檢抗體最佳工作濃度及判定標準。

1.5 雜交瘤細胞株的建立及MAb的制備 將對數(shù)生長期的SP2/0細胞與效價最高小鼠的脾淋巴細胞以1∶4～1∶10比例混合，加入融合劑PEG 4000進行融合，分別經(jīng)過選擇性培養(yǎng)基HAT、HT進行培養(yǎng)。選擇BTV1-ELISA陽性細胞克隆純化，篩選出穩(wěn)定分泌特異性MAb的雜交瘤細胞株。

1.6 MAb亞類的鑒定 按照Invitrogen公司的亞類試劑盒說明書用ELISA方法進行檢測。

1.7 Western blot鑒定 將離心收獲感染BTV1的細胞沉淀和BHK-21細胞沉淀處理后進行SDSPAGE電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉液4℃封閉過夜。以MAb上清為一抗，山羊抗鼠HRP-IgG（1∶4 000）為二抗進行western blot鑒定。

1.8 MAb抗BTV1不同蛋白的間接免疫熒光（IFA）鑒定 按照轉(zhuǎn)染試劑的操作說明，將表達BTV1的10種蛋白編碼基因的真核表達重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，以MAb上清為一抗，山羊抗鼠FITC-IgG（1∶200）為二抗進行IFA鑒定。

1.9 與BTV反應(yīng)性的IFA鑒定 將BTV 1～24型病毒株分別接種于單層BHK-21細胞中，待CPE出現(xiàn)時，棄去培養(yǎng)液，75%預(yù)冷的乙醇，4℃固定30 Min。分別加入鼠陽性、陰性血清和MAb上清，以山羊抗鼠FITC-IgG（1∶200）為二抗進行IFA鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 ELISA檢測方法的建立 經(jīng)方陣試驗測得BTV1全病毒和BHK-21 1∶50稀釋，4℃反應(yīng)過夜。5%脫脂乳37℃封閉2 h，陰陽性血清1∶3 200稀釋；一抗（MAb上清）和山羊抗鼠二抗（1∶4 000稀釋）作用最佳時間均為37℃孵育1 h，底物顯色時間為10min。

2.2 MAb的制備 細胞融合后，檢測為陽性的細胞克隆經(jīng)過3次細胞克隆純化后，共獲得3株穩(wěn)定分泌抗BTV1 MAb的陽性雜交瘤細胞株，分別命名為2B10、3D4、4H8。經(jīng)MAb亞型鑒定，3株MAb均為IgG1/κ。

2.3 Western blot鑒定 3株雜交瘤細胞培養(yǎng)上清經(jīng)western blot鑒定結(jié)果表明，4H8與BTV1的VP7蛋白反應(yīng)，3D4與BTV1的VP6蛋白反應(yīng)，而2B10沒有與變性的病毒蛋白發(fā)生反應(yīng)，而后的IFA顯示2B10與pCI-neo質(zhì)粒表達的VP7以及BTV發(fā)生反應(yīng)，推測2B10針對的是VP7蛋白上的構(gòu)象表位。所有MAb均不與對照BHK-21細胞發(fā)生反應(yīng)（圖1）。

圖1 Western blot鑒定結(jié)果Fig.1 Western blot analysis ofmonoclonal antibodies

2.4 MAb抗BTV1不同蛋白的IFA鑒定 將連有10種蛋白基因的pCI-neo真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于BHK-21細胞，用制備的MAb上清分別與其做IFA。2B10和4H8與VP7蛋白反應(yīng)，3D4與VP6蛋白反應(yīng)（圖 2）。

2.5 與BTV反應(yīng)性的IFA鑒定 用2B10、3D4、4H8 3株雜交瘤細胞培養(yǎng)上清對接種BTV 1～24型病毒株的單層BHK-21細胞以及未接種病毒的BHK-21細胞進行IFA，結(jié)果顯示這3株MAb與不同血清型的BTV均可以反應(yīng)。

VP7蛋白具有群特異性抗原決定簇，可以刺激機體產(chǎn)生群特異性抗體，在BT的群特異性血清抗體檢測中，首選是和VP7蛋白反應(yīng)的MAb[8]。和VP7蛋白一樣，VP6蛋白也是高度保守的，本研究制備的3D4同樣可以與BTV1～24型血清型發(fā)生反應(yīng)，表明VP6蛋白也可以產(chǎn)生群特異性MAb，同時證明Schwartz-Cornil等的觀點VP6在不同血清型中是相對保守的[9]，這為VP6蛋白的相關(guān)功能性研究奠定了一定基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究制備的抗BTV特異性MAb，為建立一種高效快速的檢測方法提供實驗依據(jù)，并為BTV分子生物學(xué)特性研究及建立BTV免疫學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

[1]Maan S,Nom ikou K.Complete genome characterisation of a novel 26th bluetongue virus serotype from Kuwait[J].PLoS One,2011,6（10）:e26147.Epub 2011 Oct 21.

[2]Roy P.Bluetongue virus genetics and genome structure[J].Virus Res,1989,13（3）:179-206.

[3]Mertens P P C,Brown F,Sangar D V.Assignment of the genome segments of bluetongue virus type 1 to the proteins which they encode[J].Virology,1984,135（1）:207-217.

[4]Polly Roy.Bluetongue virus:dissection of the polymerase complex[J].J General Virology,2008,89:1789-1804.

[5]Roy P,Marshall J J,French T J.Structure of the bluetongue virus genome and its encoded proteins[J].Curr Top in Microbiol Immunol,1990,162:43-87.

[6]Y u Y,Fukusho A,Ritter D G,et al.Complete nucleotide sequence of the group-reactive antigen VP7 gene of bluetongue virus[J].Nucleic Acids Res,1988,16（4）:16-20.

[7]Hosamani M,Shim izu S,Hirota J,et al.Expression and characterization of bluetongue virus serotype 21 VP7 antigen:C-term inal truncated protein has significantly reduced antigenicity[J].J Vet Med Sci,2011,73（5）:609-613.

[8]Le Blois H,Fayard B,Urakawa T,et al.Synthesis and characterization of chimeric particles between epizootic hemorrhagic disease virus and bluetongue virus:functional domains are conserved on the VP3 protein[J].JVirol,1991,65（9）:4821-4831.

[9]Schwartz-Cornil I,Mertens P P,Contreras V,et al.Bluetongue virus:virology,pathogenesis and immunity[J].Vet Res,2008,39（5）:46.