適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞系的培育

孟其麟，孫 元，李紅梅，王 楠，田大勇，仇華吉*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉 130001）

血清為血漿去除纖維蛋白的一種復(fù)雜混合物，其組成成份包括碳水化合物、血漿蛋白、多肽、脂肪、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，這些物質(zhì)為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中的激素、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)運(yùn)大分子的結(jié)合蛋白以及促接觸和伸展因子對(duì)細(xì)胞貼壁具有重要作用。

在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中，血清是一種必需成分，但仍存在一些問(wèn)題。如不同批次之間差異較大[1-2]；對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，血清并不是它們?cè)隗w內(nèi)增殖的常規(guī)環(huán)境，只有在組織損傷愈合以及血液凝固過(guò)程中才接觸血清，因此有些細(xì)胞體外使用血清有可能會(huì)改變其在體內(nèi)的正常狀態(tài)[3]。

無(wú)血清培養(yǎng)作為一種細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方案，在避免上述缺點(diǎn)的同時(shí)，還有一些新的特性，例如培養(yǎng)液成分明確，不同批次之間各成分含量無(wú)差異等，這些特性提高了培養(yǎng)基的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的一致性，并簡(jiǎn)化了純化和下游加工的過(guò)程；另外，無(wú)血清培養(yǎng)基不含動(dòng)物源性大分子蛋白，避免了細(xì)胞水平和機(jī)體內(nèi)不必要的相互作用（如疫苗接種過(guò)敏[3]）。

近年來(lái)，重組腺病毒載體作為一種疫苗載體系統(tǒng)發(fā)展較快，但現(xiàn)行的腺病毒生產(chǎn)工藝存在產(chǎn)量低、提純難、無(wú)法脫離血清培養(yǎng)等缺點(diǎn)[4-5]。

為解決以上問(wèn)題，本研究以HEK293細(xì)胞為原始材料，培育了一株適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞系，并對(duì)其病毒增殖特性和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、培養(yǎng)基、病毒株及主要試劑 HEK293

細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存；無(wú)血清培養(yǎng)液293SFM II、DMEM、FBS、GlutaMAXTM-1均購(gòu)自Life Technology公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材均購(gòu)自Corning公司；多聚賴氨酸（PDL）購(gòu)自Sigma公司；rAdV-SFV-E2為攜帶甲病毒復(fù)制子載體、表達(dá)豬瘟病毒（CSFV）E2基因的重組腺病毒[6]，由本實(shí)驗(yàn)室保存；抗豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體（MAb）HQ06為本實(shí)驗(yàn)室制備[7]；FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG（FITC-IgG）購(gòu)自Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)方法 本實(shí)驗(yàn)采用分步適應(yīng)的方法，使HEK293細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)條件，具體步驟為：首先配制含10%FBS的DMEM作為正常細(xì)胞生長(zhǎng)液。將10%FBS DMEM和293SFM II混合配制細(xì)胞適應(yīng)液，并用不同配比的適應(yīng)液培養(yǎng)細(xì)胞（表1）。

表1 適應(yīng)液的配比及培養(yǎng)代數(shù)Table 1 Ratio formulas and passages

在適應(yīng)過(guò)程中，根據(jù)細(xì)胞密度確定傳代時(shí)間。細(xì)胞處于貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，前4個(gè)血清適應(yīng)梯度的傳代均采用胰酶消化，從第5個(gè)梯度開(kāi)始改用彎頭吸管將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶表面吹下。待細(xì)胞完全適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)后，每次按2.5×105cell/mL～3.0×105cell/mL細(xì)胞濃度傳代，于37℃、8%CO2條件下中培養(yǎng)。

1.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)瓶的PDL處理PDL對(duì)細(xì)胞具有促貼壁作用，采用0.1 mg/mL的PDL于37℃孵育6 h對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行處理，并于4℃保存。

1.3.2 采用谷氨酰胺替代物代替谷氨酰胺以400 mmol/L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMAXTM-1）代替L-谷氨酰胺加入培養(yǎng)液中，配制的培養(yǎng)液在37℃，8%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱后用于細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞系的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察每代細(xì)胞傳代24 h后觀察細(xì)胞是否貼壁及其生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.4.2 細(xì)胞穩(wěn)定性將細(xì)胞連續(xù)傳16代，72 h時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)、密度，并接種病毒進(jìn)行培養(yǎng)，72 h后收獲病毒，并采用有限稀釋法測(cè)定病毒滴度。

1.4.3 病毒外源蛋白的表達(dá)將適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞（命名為293SF）與普通HEK293細(xì)胞分別于6孔板中培養(yǎng)，并適當(dāng)提高293SF的初密度，以使兩種細(xì)胞生長(zhǎng)速度同步；生長(zhǎng)36 h后接種104TCID50/mL的重組腺病毒rAdV-SFV-E2[7]，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞，用4%甲醛固定20 min，0.2%Triton X-100透膜10 min；以抗CSFVE2蛋白MAb HQ06為一抗，兔抗豬FITC-IgG（1∶100）為二抗進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）鑒定。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)血清培養(yǎng)293SF細(xì)胞的形態(tài)學(xué) 由Step1 F1代開(kāi)始，每代細(xì)胞傳代24 h后顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)的變化。Step1 F1至Step4 F3細(xì)胞逐漸收縮變圓，轉(zhuǎn)變?yōu)榘胭N壁狀態(tài)，細(xì)胞分裂減慢，平均傳代時(shí)間由48 h延長(zhǎng)至96 h；到Step5 F2時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始變?yōu)閼腋顟B(tài)；去除血清和DMEM成分后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，平均傳代時(shí)間達(dá)到72 h左右，單個(gè)細(xì)胞呈透明圓形，胞質(zhì)清亮，靜止培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)狀，并且始終懸浮于培養(yǎng)液中。

2.2 細(xì)胞穩(wěn)定性 將細(xì)胞連續(xù)傳16代，培養(yǎng)72 h時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)、密度。測(cè)定每代細(xì)胞的毒價(jià)（圖2），期間統(tǒng)計(jì)完全病變所需時(shí)間。使用普通HEK293細(xì)胞培養(yǎng)，110.30 h±10.70 h病變完全，病毒價(jià)為107.32±0.54TCID50/mL；使用適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)的293SF細(xì)胞培養(yǎng)，97.00 h±11.50 h病變完全，毒價(jià)為107.48±0.71TCID50/mL。293SF細(xì)胞增殖腺病毒的能力比普通HEK293細(xì)胞提高43.3%，并且平均生產(chǎn)時(shí)間降低了12.9%。

2.3 蛋白表達(dá)情況 收獲接種rAdV-SFV-E2 48 h的293SF和HEK293細(xì)胞，采用IFA方法檢測(cè)E2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示293SF細(xì)胞系在支持病毒復(fù)制的同時(shí)仍具有對(duì)外源蛋白的表達(dá)能力（圖3）。

3 討論

本研究采用目前較成熟的商品化細(xì)胞培養(yǎng)基，以漸進(jìn)替換法培育了一株無(wú)血清培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞系，最大限度地減少了培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞的沖擊，這對(duì)保持細(xì)胞株活性、降低細(xì)胞株變異等具有重要作用。由于該細(xì)胞系具有懸浮生長(zhǎng)的特性，難以區(qū)分正常細(xì)胞與病變細(xì)胞，為評(píng)價(jià)支持腺病毒增殖的特性造成諸多不便。因此，在增殖腺病毒及測(cè)定病毒毒價(jià)過(guò)程中，我們采用PDL對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行處理，使無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，大大提高了所測(cè)病毒毒價(jià)的準(zhǔn)確性。

目前，有多種用于無(wú)血清培養(yǎng)的293細(xì)胞系，如GIBOC 293F、HEK-293 N3S[8-9]。本研究中采用的無(wú)血清細(xì)胞原材料（HEK293細(xì)胞系）與以上商品化細(xì)胞系相同，通過(guò)改進(jìn)培育工藝和方法獲得了本細(xì)胞系，它們?cè)诒举|(zhì)上沒(méi)有區(qū)別，又能實(shí)現(xiàn)商品化細(xì)胞系的穩(wěn)定性和實(shí)用性，同時(shí)為后期實(shí)驗(yàn)節(jié)約了資金，降低了疫苗的生產(chǎn)成本。

本研究中培育的無(wú)血清HEK293細(xì)胞系能在懸浮及貼壁狀態(tài)下生長(zhǎng)。由于無(wú)血清培養(yǎng)基中不含球蛋白、抗體等干擾腺病毒感染的組分，這大大降低了腺病毒的不必要損耗。病變時(shí)間由110 h縮短到97 h，同時(shí)產(chǎn)率平均提高了43.3%，可以降低腺病毒疫苗的生產(chǎn)成本，同時(shí)為腺病毒疫苗生產(chǎn)和加工提供了便利條件。

另外，由于高劑量接種腺病毒引起細(xì)胞快速裂解死亡，細(xì)胞中大部分未成熟病毒粒子未能組裝成為具有感染性的完整病毒粒子，這會(huì)導(dǎo)致病毒毒量的下降。因此本研究采用低劑量腺病毒接種，在細(xì)胞病變初期采用IFA方法測(cè)定外源蛋白表達(dá)情況，既能避免腺病毒裂解作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，也能直觀地對(duì)比腺病毒增殖對(duì)數(shù)期的蛋白表達(dá)情況。

無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一般應(yīng)用于灌注培養(yǎng)、生物反應(yīng)器等大規(guī)模培養(yǎng)方案，本研究建立的無(wú)血清細(xì)胞系僅在實(shí)驗(yàn)室水平上對(duì)其進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)和鑒定，下一步工作重點(diǎn)是將該細(xì)胞系用于較大規(guī)模培養(yǎng)，并對(duì)應(yīng)用該細(xì)胞系生產(chǎn)的重組腺病毒疫苗進(jìn)行免疫原性及免疫效力方面的評(píng)價(jià)。

[1]Zelphati O,Uyechi S,Barron G,et al.Effect of serum components on the physico-chem ical properties of cationic lipid/oligonucleotide complexes and on their interactions with cells[J].Biochim Biophys Acta,1998,1390（2）:119-133.

[2]Mulcahy S,Sm ith R,Stacey W.Requirement for ras proto-oncogene function during serum-stimulated growth of NIH 3T3 cells[J].Nature,1985,313（5999）:241-243.

[3]Perrin P,Madhusudana S,Gontier-Jallet C,et al.An experimental rabies vaccine produced w ith a new BHK-21 suspension cell culture process:use of serum-free medium and perfusion-reactor systerm[J].Vaccine,1995,13（13）:1244-1250.

[4]Wessman J,Levings R.Benefits and risks due to animal serum used in cell culture production[J].Dev Biol Stand,1999,99:3-8.

[5]Lubiniecki S.Elim ination of serum from cell culture medium[J].Dev Biol Stand,1999,99:153-156.

[6]Sun Yuan,Li Hong-yu,Tian Da-yong,et al.A novel alphavirus replicon-vectored vaccine delivered by adenovirus induces sterile immunity against classical sw ine fever[J].Vaccine,2011,29（46）:8364-8372.

[7]Peng Wu-ping,Hou Qiang,Xia Zhao-he,et al.Identification of a conserved linear B-cell epitope at the N-term inus of the E2 glycoprotein of classical swine fever virus by phage-displayed random peptide library[J].Virus Res,2008,135（2）:267-272.

[8]Sun X,Hia C,Goh E,et al.High-density transient gene expression in suspension-adapted 293 EBNA1 cells[J].Biotechnol Bioeng,2008,99（1）:108-116.

[9]田博，吳彬，張群偉，等.懸浮培養(yǎng)HEK-293 N3S細(xì)胞生產(chǎn)重組腺病毒Ad-GFP的實(shí)驗(yàn)研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2007，23（5）：915-918.