高效液相色譜法測(cè)定人血漿中酮咯酸濃度

劉雪松，慕楊娜，姜春梅，李國(guó)信

酮咯酸(Ketorolac)為吡咯酸的衍生物，屬非甾體抗炎藥，鎮(zhèn)痛作用近似阿司匹林，肌注后鎮(zhèn)痛作用近似中等量嗎啡。肝代謝產(chǎn)物羥基酮咯酸有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，以原型由腎臟排泄。臨床用于緩解中度至重度的術(shù)后疼痛，及與外傷有關(guān)的急性腎絞痛和與癌癥有關(guān)的內(nèi)臟疼痛等［1-2］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定人血漿中酮咯酸濃度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外檢測(cè)器(LC solutionlite色譜工作軟件，日本島津公司)。酮咯酸氨丁三醇對(duì)照品(含量:99.72%，批號(hào):ABBH002305)，奧硝唑原料藥(含量:99.4%，批號(hào):090131069)，酮咯酸氨丁三醇膠囊(尼松，規(guī)格:10 mg/片，批號(hào):090801，山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，甲醇、乙腈(均為山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，色譜純)，磷酸二氫鈉(汕頭市西隴化工有限公司，分析純)，氫氧化鈉(沈陽(yáng)市正信科技研究所試劑部，分析純)。

1.2 色譜條件 Platisil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈(70∶30)(2 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至5.14±0.01);檢測(cè)波長(zhǎng)為 330 nm;流速為1.0 mL/min。

1.3 酮咯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液配制 精密稱(chēng)取酮咯酸氨丁三醇對(duì)照品適量(含量99.72%，約相當(dāng)于酮咯酸10 mg)，置100 mL量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為100.0 μg/mL的酮咯酸儲(chǔ)備液;再用50%甲醇溶液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為24.8、49.6、99.2、248.0、496.0、992.0、2 480.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱(chēng)取奧硝唑原料藥適量(含量99.4%，相當(dāng)于奧硝唑10 mg)，置100 mL量瓶中，50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為100.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，精密量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液7.0 mL至100 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為7.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

圖1 專(zhuān)屬性考察色譜圖

1.4 血漿樣品處理方法 取血漿樣品300 μL置1.5 mL離心管中，加入50%甲醇溶液30 μL，加入內(nèi) 標(biāo) 溶 液 (7.0 μg/mL 奧 硝 唑)30 μL，甲 醇900 μL，渦旋60 s，離心8 min(15 000 r/min)，取出上清液400 μL置5 mL離心管中，40℃水浴中空氣流下吹干，用400 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋混合60 s，離心 5 min(15 000 r/min)，取上清液 50 μL進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 專(zhuān)屬性考察 酮咯酸和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為11.6 min和8.6 min。酮咯酸和內(nèi)標(biāo)奧硝唑分離度良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 線性關(guān)系 精密量取空白血漿300 μL置1.5 mL離心管中，分別加入不同濃度的酮咯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各30 μL，配制成血漿中酮咯酸濃度為24.8、49.6、248.0、496.0、992.0 和 2 480.0 ng/mL的血漿樣品，按“1.4”項(xiàng)下方法操作，制備酮咯酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行雙樣本分析。以酮咯酸濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)X、酮咯酸與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(As/Ai)為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法(權(quán)重系數(shù):1/X2)進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得的線性回歸方程為 Y=-0.007 27+0.002 76X，r=0.999 7。結(jié)果表明，酮咯酸在24.8～2 480.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度 精密量取空白血漿300 μL置1.5 mL離心管中，分別精密加入不同濃度的酮咯酸質(zhì)控樣品溶液各30 μL，配制成血漿中酮 咯 酸 為 69.4(QC1)、396.8(QC2)、1 984.0(QC3)ng/mL的血漿樣品，按“1.4”項(xiàng)下方法操作，連續(xù)制備并測(cè)定3 d，每日低、中、高3個(gè)濃度，每個(gè)濃度進(jìn)行6樣本分析，計(jì)算批內(nèi)和批間的精密度(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度以及準(zhǔn)確度

2.4 提取回收率的考察 精密量取空白血漿300 μL置1.5 mL離心管中，分別精密加入不同濃度的酮咯酸質(zhì)控樣品溶液各30 μL，配制成血漿中酮咯酸為 69.4(QC1)、396.8(QC2)、1 984.0(QC3)ng/mL的血漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行6樣本分析，將各色譜峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積比較，計(jì)算本方法提取回收率，酮咯酸低、中、高3個(gè)濃度的回收率分別為 91.5% ±4.8%、95.7% ±1.6%和93.4% ±2.3%，內(nèi)標(biāo)回收率為90.5% ±3.2%。2.5 樣品的穩(wěn)定性 按“1.4”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為69.4和1 984.0 ng/mL的對(duì)照品血漿樣品各21份。分別考察其在室溫、凍融循環(huán)以及處理后樣品在室溫、冷凍條件下的穩(wěn)定性，當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣品中酮咯酸的濃度，將測(cè)定濃度的平均值與理論濃度對(duì)照，所有測(cè)定結(jié)果偏差都在15%以?xún)?nèi)，表明血漿樣品在室溫放置7 h、血漿樣品處理后室溫放置25 h、血漿樣品提取吹干后冷凍放置49 h、血漿樣品3次冷凍-解凍循環(huán)條件下穩(wěn)定性良好。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究中的應(yīng)用 24名健康男性志愿受試者進(jìn)食后30 min口服單劑量實(shí)驗(yàn)試劑20 mg，分別于給藥前及給藥后0.167(10 min)、0.333(20 min)、0.50(30 min)、0.75(45 min)、1.00、1.50、2.00、3.00、5.00、8.00、12.0、16.0、24.0 h 取靜脈血，每一階段總計(jì)取14個(gè)點(diǎn)(每點(diǎn)采血5 mL，遮光)，測(cè)定口服實(shí)驗(yàn)試劑后血漿中酮咯酸的濃度。采用Phoenix WinNonlin 6.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算24名健康志愿者口服單劑量試驗(yàn)制劑20 mg的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 24名健康志愿者口服單劑量酮咯酸氨丁三醇膠囊20 mg的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

3.1 提取條件考察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察10%三氯醋酸沉淀法處理血漿樣品，由于化合物對(duì)pH值敏感，血漿酸化處理后，待測(cè)物保留時(shí)間不穩(wěn)定，有干擾峰，影響定量分析。改用甲醇900 μL處理樣品后吹干濃縮，以流動(dòng)相復(fù)溶，提高了低點(diǎn)濃度的響應(yīng)值，避免了溶劑效應(yīng)，提高了柱效，基線平穩(wěn)，無(wú)內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。

3.2 內(nèi)標(biāo)物選擇 本實(shí)驗(yàn)分別應(yīng)用酮咯芬、替硝唑等化合物作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，結(jié)果奧硝唑出峰時(shí)間合適，峰形良好。奧硝唑出峰時(shí)間對(duì)流動(dòng)相的pH值敏感，可以通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相的pH值來(lái)調(diào)整化合物和內(nèi)標(biāo)的出峰位置，排除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)確定 文獻(xiàn)中大多選取315 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)［3］，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)酮咯酸氨丁三醇進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)為322 nm，并且在330 nm處仍有較強(qiáng)吸收，本實(shí)驗(yàn)最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，進(jìn)一步減少了內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。波長(zhǎng)掃描圖見(jiàn)圖2。

圖2 酮咯酸氨丁三醇紫外波長(zhǎng)掃描圖

3.4 待測(cè)組分確定 酮咯酸氨丁三醇進(jìn)入人體后迅速分解為活性物質(zhì)酮咯酸［4］，由于沒(méi)有市售酮咯酸對(duì)照品，只能采用酮咯酸氨丁三醇的對(duì)照品。本實(shí)驗(yàn)為了證明氨丁三醇不干擾待測(cè)物酮咯酸的檢測(cè)，對(duì)氨丁三醇(2 mg/mL)進(jìn)行了紫外掃描，結(jié)果顯示，氨丁三醇在波長(zhǎng)190～200 nm處有明顯吸收，在330 nm處無(wú)吸收。因此，本實(shí)驗(yàn)中氨丁三醇不干擾待測(cè)物的檢測(cè)。波長(zhǎng)掃描圖見(jiàn)圖3。

圖3 氨丁三醇紫外波長(zhǎng)掃描圖

3.5 藥動(dòng)學(xué) Tmax和 Cmax與文獻(xiàn)報(bào)道有差異［5］，文獻(xiàn)報(bào)道禁食12 h后口服單劑量10 mg藥物的Cmax為810 ng/mL，根據(jù)藥動(dòng)學(xué)線性關(guān)系計(jì)算單劑量給藥20 mg后，Cmax應(yīng)為1 620 ng/mL，而本實(shí)驗(yàn)為(1 351.7±310.9)ng/mL。此外，本實(shí)驗(yàn)中Tmax為(1.86±0.58)h與文獻(xiàn)中的(0.89±0.63)h相差大約1 h。原因可能是食物減少了酮咯酸的吸收并延后了達(dá)峰時(shí)間。

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